B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기
Summary
여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
B 형 간염 바이러스 (HBV) 만성 감염은 만성 간 질환 (1)의 주요 위험 인자이다. 현재의 치료 전략은 인터페론 – 자극 된 유전자의 기능이 관통 HBV의 POL 기능 및 / 또는 감염된 개인에서 면역 반응을 활성화 타입 I 인터페론의 투여뿐만 아니라 간접적으로 억제 HBV의 증식을 억제 뉴클레오티드 유사체에 기반하지만, 이러한 치료는 HBV를 제거 할 수없는 DNA 완전히 3. 또한, 안티 폴 화제에 내성 HBVs의 출현 문제 4이다. 직접 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 라이프 사이클의 상이한 단계를 타겟팅 결합 항 바이러스제의 투여가 성공적으로 억제하거나 바이러스 (들)를 박멸 도시 하였다. 이 아이디어는 H의 상이한 단계에 직접 작용 항 HBV 제 (들)의 개발과 마찬가지로BV 라이프 사이클 미래 HBV 치료를 설정하는 것이 중요하다.
일반적으로, 대상 바이러스의 시험 관내 배양 시스템에서 간단한의 설립은 항 바이러스 제제의 개발을 용이하게한다. 그러나, 항 HBV 제를 선별 할 수있는 시험 관내 배양 시스템의 개발에 대한 적어도 두 개의 장벽이있다. 첫 번째는 HBV 감염 / 확산 편리한 생체 외 세포 배양 시스템의 부족이다. 확립 된 세포주에서 전파 예컨대 HIV와 같은 다른 HCV 바이러스, 달리 때문에 좁은 숙주 범위 제한을 포함하여 실험 관내에서 HBV 양성하기 어렵다. 이러한 HBV 감염, 5, 6에 취약 인간 간암 세포주 HepaRG, 특정 세포 배양 시스템의 사용은도 7에 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 또한, 유로 키나아제 TY에서 분리 PXB 세포체육 플라스 미노 겐 활성제의 형질 전환 / 차 인간 간세포 (PHH) 접종 SCID 마우스는 HBV 감염과 복제 팔에 민감한 것으로 나타났다. 그러나 HepaRG에서 HBV 복제 수준은 HBV 감염 / 복제 수준의 일관성과 재생 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다 배양 한 후 세포 분화 상태에 따라 달라집니다. PXB는 일반적으로 HBV 감염 실험에 사용되지만 가용성에 의해 제한된다. 테트라 사이클린 유도 HBV 발현 세포주 HepAD38도 널리 HBV 복제를 연구하는 데 사용했지만,이 시스템은 전사 후하지 HBV 감염 (9)의 입력 단계에서 평가를 허용한다. 최근에, HBV에 대한 기능적 수용체 나트륨 타우로 콜산의 cotransporting 폴리펩티드의 동정 (NTCP)는 가변 HBV 배양 시스템 (10)의 개발을 허용했다. 실제로, 이러한 Huh7 비 감수성 간암 세포에서 발현 NTCPHepG2 세포는 HBV 감염을 열 수있게하고, 따라서, HBV 감염 세포주의 선택은 실험 많은 한계를 해결 확장되었다. 두 번째 문제는 HBV 감염 및 복제를 평가하기위한 간단한 분석 시스템의 부족이다. HBV 감염의 평가는 일반적으로 HBV DNA, RNA 및 단백질을 분석함으로써 수행된다. 그러나 이러한 바이러스 마커의 정량은 종종 비용이 많이 들고 항상 간단하지가 시간 소비이다. 따라서, 간단한 분석 시스템의 개발은, 예컨대 리포터 유전자를 사용하여 같은 HBV 분석 시스템과 관련된 문제를 극복 할 수있다.
그러나, HBV 캡시드로 패키징 될 수있는 게놈 크기가 제한되기 때문에 – 미만 3.7 KB 11 – 리포터 유전자의 크기가 가능한 한 짧아야한다. 또한, 바이러스 복제에 필수적인 게놈 흩어져 여러 시스 엘리먼트의 존재에 대한 가능한 위치를 제한 게놈에 리포터 유전자의 sertion. 몇몇 보고서는 HBV 게놈 11, 12, 13로, HIV-1 문신, 녹색 형광 단백질 및을 DsRed을 포함하여 외래 유전자를 삽입하려고했습니다. 그러나 이러한 재조합 HBVs는 HBV 감염 / 복제, 또는 HBV 감염 / 복제에 영향을 미치는 요인의 높은 처리량 검사 선별에 유용하지 않다. 이것은 주로 때문에 재조합 바이러스의 낮은 생산성과 비효율적 바이러스 생산에 의한 리포터 유전자 발현의 감소 된 강도이다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 바이러스 생산의 고 수율을 가진 리포터 HBV를 구축 하였다. 이 바이러스는 전사 엔트리에 상기 HBV 복제 사이클의 초기 모니터링을위한 매우 민감하다. 이 작은 (171 개 아미노산)이 발광 기자를 설계하기 때문에이를 위해 NanoLuc (NL)는 마커 유전자로서 선택되었다클래스 = "외부 참조"> 14. 또한, NL 반딧불 또는 레 닐라 루시퍼보다 밝은 150 배 정도이고, 상기 발광 반응을 잘못된 히트 율이 높은 처리량 스크리닝 낮을 것으로 제안 ATP 독립적이다. 재조합 HBV의 생산 효율은 약 1/5 모 HBV의 이전 HBV 재조합 바이러스보고 수준과 유사하다; 이 항 HBV 제제의 질량 검사에 사용될 수 있지만, NL의 밝기 바이러스 생산성 문제를 극복한다.
기본 간세포를 사용하여 안티 HBV 요원의 검사는 HepaRG, HepAD38 및 NTCP-형질 간세포는 종래의 방법 (들)에 의해 항 HBV 에이전트의 심사에 유용 할 수 있습니다. 그러나, 여기에 설명 된 시스템은 간단한 처리, 고감도 및 스크리닝 저비용 등의 다양한 이점이있다. 이러한 장점 개발 및 치료 목적 HBV 새로운 에이전트를 식별하기위한 고 처리량 분석에 적합하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
B 형 간염 게놈 코어, 폴리머, 표면 및 X의 ORF (그림 1) 등 4 차 오픈 리딩 프레임 (ORF를)가 있습니다. 이 네 HBV 개의 ORF의 전사가 단단히 네 프로모터에 의해 조절된다 다음 precore / 핵심 프로모터 인핸서 II를 포함, S1 프로모터, S2 프로모터 및 X 프로모터 인핸서 (18) I를 포함. 3.5 킬로바이트 및 3.4 킬로바이트의 mRNA는 각각 PreCore 및 핵심 단백질로 번역된다. 큰 봉투 단백?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
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