دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد
Summary
يستخدم هذا البروتوكول كل من coexpression الوحيدات وحدة فرعية postlysis خلط لإجراء فحص أكثر دقة التجمع proteasome والمؤتلف.
Abstract
تم العثور على جسيم بروتيني في جميع مجالات الحياة. أنها توفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا في حقيقيات النوى، ولكن ليس من المفهوم جمعيتهم تماما. كل جسيم بروتيني تحتوي على الجسيمات محفوظ الهيكلية الأساسية (CP)، أو 20S proteasome و، تحتوي على اثنين heptameric حلقات فرعية β تقع بين اثنين من حلقات α فرعية heptameric. Archaeal 20S جسيم بروتيني أبسط إنشائي مقارنة مع نظرائهم حقيقية النواة، ولكن كلا منهما متشاركين في آلية تجميع المشتركة. وبالتالي، فإن archaeal 20S جسيم بروتيني لتكون نماذج هامة لتجميع proteasome وحقيقية النواة. على وجه التحديد، قد حقق التعبير المؤتلف من 20S archaeal جسيم بروتيني جانب nondenaturing هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) العديد من الأفكار الهامة في نشوء حيوي proteasome و. هنا، نحن نناقش وسيلة لتحسين بناء على استراتيجية المعتادة من coexpression من α proteasome وarchaeal وبيتا مفارز قبل nondenaturiنانوغرام PAGE. علينا أن نبرهن على الرغم من سرعة وكفاءة، واتباع نهج coexpression وحده يستطيع ان يشتاق سيطة التجمع الرئيسية. في حالة proteasome و، coexpression قد لا تسمح الكشف عن نصف proteasome و، والمتوسطة التي تحتوي كاملة α-حلقة واحدة وكاملة β-حلقة واحدة. ومع ذلك، تم الكشف عن هذا المتوسط بسهولة عبر المحللة الاختلاط. نقترح أن الجمع بين coexpression مع المحللة خلط ينتج نهج أكثر شمولا في تحليل التجمع، ومع ذلك لا تزال nonintensive العمل. قد يكون هذا النهج مفيدا لدراسة المجمعات multiprotein المؤتلف أخرى.
Introduction
المجمعات Multiprotein تنفذ العديد من الأنشطة الخلوية الحيوية 1. بالنسبة لكثير من هذه المجمعات، يعرف الكثير عن هيكل وظيفة من حول جمعيتهم 2،3. وproteasome وهو واحد من هذا القبيل معقدة ويوجد في جميع مجالات الحياة. في حقيقيات النوى، وهذا الجهاز الجزيئية هي في صميم النظام proteasome و/ اليوبيكويتين (يو بي إس)، ويوفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا 4. وتتألف proteasome وحقيقيات النوى (ويشار إلى أن proteasome و26S) اثنين من المجالس الفرعية رئيسيين: proteasome و20S، أو كور الجسيمات (CP) 5، والتي يمكن أن توج على واحد أو كلا الطرفين من الجسيمات التنظيمي 19S (RP) 6.
وproteasome و20S هو الأنزيم البروتيني مجزأة كبير. ويحفظ لها هيكل رباعي على الاطلاق في جميع مجالات الحياة، ويتألف من كومة من أربع حلقات سبعة membered تحتوي على نوعين من الوحدات الفرعية المرتبطة هيكليا، α. وبيتا 5،7،8. في حقيقيات النوى، وتتألف اثنين من حلقات الخارجي لكل من سبع مفارز α متميزة واثنين من الحلقات الداخلية وتضم كل من سبع مفارز β متميزة. يقيم نشاط بروتين في غضون ثلاث مفارز β. على النقيض من ذلك، حلقات CP من العتيقة والبكتيريا وتتألف عادة من نوع واحد فقط من α ونوع واحد من الوحيدات بيتا. وقد وفرت جسيم بروتيني Archaeal نظام نموذجا هاما لدراسة التجمع proteasome وعلى حد سواء بسبب بساطتها التركيبية وعلى تقاسم آلية تجميع مشتركة مع نظرائهم حقيقية النواة من 9-13. وباختصار، مفارز ألفا التجمع في حلقات α أولا، التي تكون بمثابة سقالة على الذي بيتا مفارز تجميع. الناتج-جسيم بروتيني نصف (α 7 β 7) dimerize، مما أدى إلى تجميعها بشكل كامل CP (α 7 β 7 β 7 α 7). خلال dimerization، وpropeptides تقديم على مفارز بيتاتتم إزالة autocatalytically، وفضح threonines N-محطة الحفاز. استخدام جسيم بروتيني archaeal لنموذج التجمع في كثير من الأحيان يستفيد من إنتاج المؤتلف بروتينات proteasome وarchaeal في القولونية. هذا هو نهج جدير بالاهتمام لأنه تمكن مفارز إلى أن يتم إنتاجها في توليفات مختلفة، على حد سواء WT والإصدارات متحولة، في كائن المضيف الذي لا ينتج جسيم بروتيني الخاصة بها.
رصد التجمع من المجمعات متعددة البروتين يتطلب كيميائيا نوع من طريقة تجزئة الذي يفصل بين المجمعات تجميعها بشكل كامل من وسيطة التجمع والسلائف. وقد ثبت نظرا لقدرتها الفائقة حل، nondenaturing إس دي إس بايج (PAGE) لتكون مفيدة بشكل خاص في تجزئة من مختلف المجمعات multiprotein كبيرة 14-17. أصبح الجمع بين المؤتلف إنتاج proteasome وarchaeal و PAGE nondenaturing طريقة فعالة في dissectinز proteasome والتجمع 9،11،12،18. ومع ذلك، فإن الطريقة المعتادة التي يتم تطبيق هذا النهج (أي عن طريق coexpression المؤتلف من α و β مفارز) لديه عيب المهم. ردود الفعل الجمعية هي التعاونية وبقوة 3-يعتمد التركيز. وبالنظر إلى أن تركيز البروتين داخل الخلايا عالية جدا 19، وذلك بسبب الآثار حجم المستبعدة، ردود فعل التجمع المضي قدما بسرعة في الجسم الحي. وبالتالي فإنه من الممكن أن يغيب سيطة التجمع المهمة عندما يتم coexpressed α و β مفارز.
هنا، فإننا نقول للنهج المشترك في الدراسة التجمع proteasome وباستخدام المؤتلف مفارز proteasome وarchaeal. في هذا النهج، والعاملين على حد سواء أساليب خلط coexpression والمحللة. يسمح السابق للتحليل السريع للتجميع بسبب coexpression أقل كثافة اليد العاملة. هذا الأخير يعتمد على التعبير منفصل من α و β مفارز، تليها خلط. على الرغم من هذا requiالدقة أكثر قليلا من الجهد من coexpression، هو أكثر من كاف للتعويض عن القدرة على الكشف عن وسيطة التي غاب خلال coexpression. معا، يمكن أن هاتين الطريقتين توفير صورة أكثر اكتمالا التجمع proteasome و.
Protocol
Representative Results
Discussion
علينا أن نبرهن صالح نهج موحد لتحليل التجمع proteasome والتي nondenaturing PAGE باستخدام جسيم بروتيني archaeal المؤتلف. على 9،11 الأسلوب المعتاد لcoexpression البكتيرية مفارز proteasome ويسمح للتحليل السريع ولكن قد لا تكشف عن وسيطة التجمع الرئيسية. نقترح الجمع بين coexpression مع المحللة خلط لتط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من دعم البحوث أموال المنحة (RSFG) من جامعة إنديانا جامعة-بوردو، انديانابوليس، والجزء الآخر من جائزة من جمعية القلب الأمريكية 14GRNT20390154، إلى ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
