Undersøke Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomer og Nondenaturing SIDE: The Case for en kombinert tilnærming
Summary
Denne protokollen bruker både subenhet koekspresjon og postlysis subenheten blande for en mer grundig undersøkelse av rekombinant proteasome montering.
Abstract
Proteasomer finnes i alle områder av livet. De gir den viktigste ruten for intracellulær protein nedbrytning i eukaryoter, selv om deres forsamlingen ikke helt forstått. Alle proteasomer inneholde en strukturelt konservert kjernepartikkel (CP), eller 20S-proteosomet inneholder to heptameric p-subenhet-ringer klemt mellom to heptameric α subenhet ringer. Archaeal 20S proteasomer er sammensetnings enklere i forhold til sine eukaryote kolleger, men de begge deler en felles montering mekanisme. Derfor archaeal 20S proteasomer fortsette å være viktige modeller for eukaryote proteasome montering. Nærmere bestemt har rekombinant uttrykk for archaeal 20S proteasomer kombinert med nondenaturing polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) ga mange viktige innsikt i proteasome biogenesis. Her diskuterer vi et middel til å forbedre den vanlige strategien for koekspresjon av archaeal proteasomer α og p-subenheter før nondenaturing SIDE. Vi viser at selv om rask og effektiv, kan en koekspresjon tilnærming alene savner sentrale monteringsmellomprodukter. I tilfelle av proteosomet, kan koekspresjon ikke tillate påvisning av den halv-proteosomet, et mellomprodukt inneholdende en komplett α-ring og en fullstendig β-ring. Men dette mellomproduktet kan lett detekteres via lysat blanding. Vi foreslår at å kombinere koekspresjon med lysat blanding gir en tilnærming som er mer grundig i å analysere montering, men fortsatt arbeid nonintensive. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for studier av andre rekombinante multiprotein komplekser.
Introduction
Multiprotein komplekser utføre en rekke kritiske cellulære aktiviteter 1. For mange av disse kompleksene, er mye mer kjent om deres struktur og funksjon enn om deres montering 2,3. Proteasome er en slik kompleks og finnes i alle områder av livet. I eukaryoter, er denne molekylære maskinen i kjernen av ubiquitin / Proteasome system (UPS) og gir den store rute for intracellulær proteindegradering 4. Den eukaryote proteasomet (også omtalt som den 26S-proteasomet) består av to store sub-sammenstillinger: en 20S-proteosomet, eller Core Particle (CP) 5, som kan bli avkortet på den ene eller begge ender av en 19S Regulatory partikkel (RP) 6.
Den 20S proteasomet er et stort compartmentalized protease. Dets kvaternære struktur er fullstendig konservert i alle områder av liv, og består av en stabel av fire syv-leddede ringer inneholdende to typer av strukturelt beslektede subenheter, α; og p 5,7,8. I eukaryoter, er de to ytre ringer hver består av syv forskjellige a-subenheter og to indre ringer er hver består av syv forskjellige p-underenheter; proteolytisk aktivitet ligger innenfor de tre p-underenheter. I motsetning til dette blir de CP ringer av archaea og bakterier vanligvis består av bare en type α og en type β subenheten. Archaeal proteasomer har gitt en viktig modellsystem for å studere proteasome montering både på grunn av sin kompositoriske enkelhet og deres deler en felles montering mekanisme med sine eukaryote kolleger 9-13. I korte trekk, a-subenheter montere inn a ringer først, som tjener som et stillas hvorpå p-subenheter montere. De resulterende halv proteasomer (α 7 β 7) dimerisere, gir opphav til ferdig montert CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerization, propeptidene presentere på p-subenheterer autocatalytically fjernet, utsette de katalytiske N-terminale treoniner. Bruken av archaeal proteasomer for å modellere montering finner ofte fordel av produksjon av rekombinante archaeal proteasomer proteiner i Escherichia coli. Dette er en verdig tilnærming fordi det muliggjør at underenheter som skal produseres i forskjellige kombinasjoner, som både WT og muterte versjoner, i en vertsorganisme som ikke produserer sin egen proteasomer.
Overvåking av sammenstillingen av multiproteinkomplekser biokjemisk krever noen form for fraksjoneringsmetode som skiller ferdig montert komplekser fra monteringsmellomprodukter og forløpere. På grunn av sin overlegne løse kapasitet, nondenaturing polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) har vist seg å være spesielt nyttige ved fraksjonering av forskjellige store multiprotein komplekser 14-17. Kombinasjonen av rekombinant archaeal proteasome produksjon og nondenaturing siden har blitt en kraftig tilnærming i dissecting proteasome montering 9,11,12,18. Men den vanlige metode ved hvilken denne metoden anvendes (f.eks. Via det rekombinante koekspresjon av a- og p-subenheter) har en viktig ulempe. Monterings reaksjoner er samarbeidsvillig og sterkt konsentrasjonsavhengig tre. Gitt at proteinkonsentrasjonen inne i cellene er meget høy 19, på grunn av utelukkede volumeffekter, montering reaksjoner forløper hurtig in vivo. Derfor er det mulig å gå glipp av viktige monteringsmellom når a og p subenheter er koekspresjon.
Her argumenterer vi for en kombinert tilnærming i studiet av proteasome settet med rekombinante archaeal proteasomer subenheter. I denne fremgangsmåten, blir begge koekspresjon og lysat blandemetoder anvendes. Den tidligere muliggjør rask analyse av forsamlingen fordi koekspresjon er mindre arbeidskrevende. Sistnevnte er avhengig av egen ekspresjon av a og p-underenheter, etterfulgt av blanding. Selv om dette krav som stillesres litt mer innsats enn koekspresjon, er det mer enn kompensert for ved evnen til å oppdage mellom som er savnet under koekspresjon. Til sammen kan disse to metodene gir et mer fullstendig bilde av proteasome montering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser til fordel for en kombinert tilnærming til å analysere proteasome montering av nondenaturing PAGE ved anvendelse av rekombinante archaeal proteasomer. Den vanlige metoden for bakteriell 9,11 koekspresjon av proteasomer underenhetene gjør det mulig for hurtig analyse, men kan ikke avsløre nøkkelmontasjemellomprodukter. Vi foreslår å kombinere koekspresjon med lysat blanding for å utvikle et bredere bilde av monterings hendelser.
Fordelen med denne kombinerte fremga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av en forsknings Support Funds Grant (RSFG) fra Indiana University-Purdue University, Indianapolis, og delvis av en pris fra American Heart Association 14GRNT20390154, til ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
