동적 광산란 현미경에 의한 혼탁 솔루션의 입자 크기 분포 측정

Summary

동적 광산란 현미경을 사용하여 진한 용액의 입도 분포를 직접 측정하기위한 프로토콜이 제시된다.

Abstract

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Introduction

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protocol

1. 샘플 준비 온도에 반응 단량체의 정제 톨루엔 100 mL에 N의 이소 프로필 아크릴 아미드 20 g의 (NIPA)을 녹인다. 먼지를 제거하기 위해 흡인 하에서 용액 필터. 석유 에테르 500 ㎖로 여과 액을 혼합한다. 빙수 욕에서 반응 용기를 배치했다. 단량체가 (일반적으로 30 분) 침강 될 때까지 용액을 교반한다. 침전 된 단량체를 수득 흡인 하에서 용액 필터. 하룻밤 감압 (100 PA)에서 단량체를 건조. 온도 응답 성 폴리머 용액의 제조 다이어프램 펌프를 이용하여 1.0 분 동안 탈 이온수 20 ㎖ 드가. 탈기 및 탈 이온수 9.5 ml에 정제 NIPA의 780.8 mg의 녹인다. 빙수 욕에서 반응 용기를 배치했다. 의 반응을 방패알루미늄 호일로 덮고 장치에 의한 빛. 조심스럽게 튜브를 가스 실린더에 부착 된 피펫 팁을 통해 Ar 가스의 완만 한 흐름을 도입하면서 10 분 동안 부드럽게 교반 용액. N, N, N의 11.9 μL ', N'마이크로 피펫을 통해 솔루션 -tetramethylethylenediamine를 추가합니다. Ar 가스를 도입하면서 단계 1.2.5에서 설명한 바와 같이, 1.0 분 동안 용액을 교반 하였다. 샘플을 교반하면서 탈기시키고, 탈 이온수 0.5 ml에 황산 암모늄 4.0 mg을 용해. 및 (단계 1.2.8)에서 황산 암모늄 용액 (단계 1.2.7)에서 시료 용액을 혼합한다. 아르곤 가스를 도입하면서 단계 1.2.5에서 언급 한 바와 같이 30 초 동안 용액을 교반 하였다. 알루미늄 호일로 솔루션을 덮고 하룻밤 냉장고 (4 ℃)에 보관합니다. 샘플 마운트의 준비 에서 (검액 60 μL를 놓습니다공동 슬라이드 단계 1.2.11). 원형 커버 유리 솔루션을 커버. 트랩 공기 방울에주의하지 말라. 마이크로 피펫 및 실험실 와이프를 사용하여 초과 솔루션을 제거합니다. 접착제와 샘플을 밀봉합니다. 실내 온도 (일반적으로 6 시간)에 접착제를 건조하게 할 수 있습니다. 단계 1.3.1-1.3.4에 따라 0.1 중량 %의 폴리스티렌 라텍스 (100 나노 입자 직경) 서스펜션 가득 다른 슬라이드를 준비합니다. 이 슬라이드는 표준으로서 사용된다. 동적 광산란 현미경 2. 입자 크기 측정 장비의 최적화 거꾸로 현미경의 무대에 (단계 1.3.5에서) 폴리스티렌 라텍스 서스펜션 슬라이드를 놓습니다. 커버 유리 측 하방으로 직면한다. 검출기의 앞에 빔 댐퍼 (눈사태 포토 다이오드 및 상관기)를 놓습니다. 레이저 빔 (고체 레이저, λ = 488 nm의 30 mW의 적용 연속대물 렌즈를 통해 샘플에 파) (10 ×). 반사 된 빛의 일부는 현미경 발사 미러를 통과하고, CCD 카메라에 의해 관찰 현미경 (도 1)의 양측 포트에 장착된다. 로우 – 하이 위치로부터 대물 렌즈의 높이를 변화하여 샘플 현탁액에 초점을 설정하는 대물 렌즈의 높이를 조정한다. 커버 유리 샘플 사이의 계면에서, 상기 커버 유리의 표면에, 샘플 및 홀 슬라이드 글라스 사이의 계면에서이 절차 동안에, 반사 이미지가 세 번 초점을 맞추고있다. 두 번째 및 세 번째 지점 사이의 중심점을 설정한다. 레이저 파워를 변경하여 산란 광 강도를 감쇠. 검출기 앞에 빔 댐퍼를 제거하여 검출기에 산란광을 소개한다. 이 장치는 빛의 세기의 시간 상관 관계를 측정한다. betw 핀홀 (φ = 50 μm의)를 설정공 초점 효과를 달성하기 위해 현미경 및 검출기 EEN. 검출기에서의 광 강도를 최대화하기 위해 핀 홀의 위치를 ​​조정한다. 컴퓨터를 통해 상관기의 동작을 개시하여 30 초 동안 광 산란 강도의 시간 상관 함수를 측정한다. 1, t는 시간 상관 (4)와 인 – 측정 된 상관 함수는 종종 g (2) (t)로 표현되는 . 여기서, I (t)는 시간 t와 (•••) T 시간 평균이다에서 산란 된 광 강도이다. 감쇠 시간은 약 0.1 밀리 것이다. 시간 상관 함수의 초기 진폭 넓은 범위를 획득하기 위해 초점을 조정 (g (2) (t = 0) – 1). 참고 : 초기 진폭이 강하게 반사되는 빛의 양에 의해 영향을 받는다. 초점 토우를 이동하여커버 유리 시료, 반사광 량이 증가 사이의 인터페이스를 ARD. 폴리스티렌 라텍스 강한 광 산란의 경우, 초기 진폭 그러나 0에서 1로 변경 될 수 있고, 이는 반사 된 광의 강도는보다 더 높기 때문에 더 일반적인 중합체 용액 1에 가까운 초기 크기를 설정하는 것은 어렵다 산란 된 빛의. 역 라플라스 변환 크기 분포 함수를 획득하는 획득 된 시간 상관 함수 (제한된 정규화 CONTIN 프로그램 (13, 14)을 사용)을 적용한다. 초기 진폭이 0.2 미만으로 설정된 경우, 유체 역학적 반경의 분포 함수를 두 번 실제 반경 (자세한 설명을 참조)은 100 나노 미터 주위에 날카로운 피크를 표시한다. 시료 측정 25 ° C의 단계 온도를 설정합니다. 폴리 NIPA (PNIPA) 오디오 솔루션을 준비 슬라이드를 배치이온 현미경의 무대에 (단계 1.3.4). 단계 2.1.4-2.1.8 따라 산란 된 광 강도의 시간 상관 함수를 측정한다. 초기 진폭이 0.2보다 큰 경우, 단계 2.1.9에 따라 시간 상관 함수의 초기 진폭 있도록 0.2 미만인 초점을 조정한다. 작은 초기 진폭은 분석을 단순화합니다. 35 ° C의 단계 온도 설정 및 용액이 혼탁 될 때까지 기다립니다. PNIPA 용액의 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 C 15 – 32 °이다. 다음 단계에서 시간 상관 함수를 측정 2.1.4-2.1.8. 가능하면, 시간 상관 함수 0.2 미만의 초기 진폭 있도록 초점의 위치를 ​​조정한다. 탁한 용액 들어, 초기 진폭 반사광 즉 일정하게 유지하면서 산란광의 강도가 증가하기 때문에, 증가하는 경향이있다. 역 라플라스 transformati 적용얻어진 시간 상관 함수의 크기 분포 함수를 얻었다. 실제 크기가 초기 진폭이 0.2 미만인 경우에는 반 얻어진 값이 있습니다.

Representative Results

폴리스티렌 라텍스 현탁액에 대한 산란 광량의 시간 상관 함수 (입자 반경이 50 nm 인)은도 2에 도시 된 바와 같이, 다양한 초점 지점에서 측정 하였다 (a). 이 상관 함수는 상기 역 라플라스 변환에 의해 유체 역학적 반경의 분포 함수로 변환하고 (도 2 참조 (b) 및 (c)). 동일한 절차를 사용하여, PNIPA 용액의 유체 역학적 반경의 시간 상관 함수와 분포 함수는 각각, 25 ° C에서 얻어진 35 ° C 하였다. 도 3 (a) 및 (b) 산란 광 강도의 시간 상관 함수와 상기 PNIPA의 아래 수용액 (25 ° C) 및 (35 ° C)에 LCST의 대응 크기 분포 함수를 나타낸다. 크기 분포 함수는 다음 역 라플라스 변환에 의해 얻어졌다부분 헤테로 다인의 보정. LCST 아래 평균 역학적 반경이 중합체 용액에 대한 전형적인 수십 나노 미터이다. 대조적으로, 전술 한 LCST 유체 역학적 반경은 약 1.0 μm의 것이다. 이러한 결과는, 용액이 혼탁 LCST 상기 사실과 일치한다. 도 3의 적색 및 청색 라인 직후, 용액을 20 분 후에 각각 PNIPA 혼탁 된 용액의 입도 분포를 나타낸다. 도 3 (b)에 명확하게 통합의 성장을 나타낸다. 도 동적 광산란 현미경 1. 회로도. 핀홀 (PH), 빔 스플리터 (BS), 편광판 (POL) 및 애벌랜치 포토 다이오드 (APD). 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전. 폴리스티렌 라텍스 서스펜션 2. 대표 결과 그림. (a) 폴리스티렌 라텍스 현탁액에 대한 산란 광량의 시간 상관 함수. 공칭 반경은 50 ㎚이다 및 농도 0.1 중량 %이다. 두 개의 데이터 셋이 서로 다른 산란 점에서 얻어졌다. (b)의 역 라플라스 변환에 의해 얻어진 폴리스티렌 라텍스 서스펜션 (c) 대응 사이즈 분포 함수 (a). 적색 선은 그 초기 진폭을 약 1.0 시간 상관 함수에 대응하고, 청색 라인은 약 0.2 초기 진폭에 상응. 횡축은 헤테로 부분 (PHD)의 효과를 고려하여 (b)없이 (c)로 계산되었을 때 << ; 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 A PNIPA 솔루션 3. 대표 결과. (a)에 PNIPA 솔루션 산란광 강도의 시간 상관 함수. (b) (a)의 역 라플라스 변환에 의해 얻어진 PNIPA 솔루션 대응 사이즈 분포 함수. 횡축은 각 데이터 세트에 대한 부분적 헤테로의 영향을 고려하여 계산 하였다. 검은 선은 25 ° C에서 얻은 데이터를 나타낸다. 빨간색 선은 용액이 혼탁 온 직후 얻은 데이터 (35 °에 C)를 나타냅니다. 파란색 라인은 레드 라인의 20 분의 측정 후에 얻어진 데이터를 나타냅니다./54885/54885fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

시간 상관 함수의 초기 크기는 주로도 2에 도시 된 바와 같이, 중심점에 따라 (a). 이 겉보기 용액 (계면에서 박막 제외) 균질하다는 사실을 ⁸ 모순. 초기 진폭이 변화는 반사 광량의 변화에 ​​기인한다. 일부 헤테로 다인 이론 ^(16)는 초기 진폭 A, 산란광 강도, I _S, 반사광 강도, I는 _R, 다음 식을 만족하는 것으로 예상 ^한

이 방정식은 내가 _r에 큰이되고 있음을 보여주고, 작은 A는된다. 따라서, 인터페이스에 가까운 초점 위치를 설정함으로써 감소된다. 겉보기 확산 상수 D _A는 캘리포니아N 단 분산 용액의 경우에는 시간 상관 함수 피팅에 의해 획득 될 :

어디에 . 여기서, n은 용매 (물, 1.33)의 굴절률이며, θ는 산란 각 (180)은이고, λ는 빛 (514.5 ㎚)의 파장이다. 우리는 후방 산란 기하학을 적용하기 때문에, Q의 값은 고정된다. 그러나,이 점은 상이한 파장의 광을 이용하여 해결된다. 연속파 레이저 소스의 종류는 DLS 현미경을 구성하는 데 사용할 수 있습니다. 작은 부피 조사 덕분에, 코 히어 런스 팩터 ^(17)보다 0.99로 추정 무시할 수있다. 다 분산 용액의 경우, D _(A)의 분포 함수는 상기 역 라플라스 변환함으로써 얻어진다. 부분 헤테로 다인 일eory 또한 _{D, A는} 실제의 확산 정수 D와 동일한 아니라는 것을 예측한다. 이러한 두 확산 상수는 다음 방정식을 만족

확산 상수 D는 아인슈타인 스톡스 식 ^4를 이용하여 유체 역학적 반경 R에서 _H로 변환된다. A = 1이 관계의 _A = D D이되면. 이 경우에, 데이터 변환 처리는 일반적인 동적 광산란에 대한 것과 동일하다. 도 2 (b)에 도시 된 적색 라인이 경우에 해당한다. 반대로, 이러한 관계는 한계에서 D의 _A = 0.5 D된다 → 0 A가 작은 (실제적으로 0.2 미만)을 때 같이 따라서, 크기는 실제 크기보다 두 배 큰 것으로 추정된다 도 2 (b)의 청색 라인 </strong>. 우리는 상당히 작다는 것을 알고있는 경우도 2 (c)에 나타낸 바와 같이, 횡축은, 이동 될 수있다. 원칙적으로, 우리는 어떤 값을 D로 D _A를 변환 할 수 있습니다. 간단한 근사화 D _A를 0.5 ~ D가 성립 때문에 그러나 실제로는 0.2 초기 진폭을 작게 설정하는 것이 좋다.

동적 광 산란 현미경 기술의 두드러진 특징으로는 PNIPA 용액을 사용하여 입증되었다. 아래 및 LCST 상기 PNIPA의 형태 광범위 ^{15,18 산란} 소각 중성자를 이용하여 연구되었다. 반면, 동적 광산란 때문에 탁도 ^(19)의 LCST 상기 PNIPA 분석에 활용되지 않았다. 도 3에 도시 된 바와 같이,이 문제는, 동적 광 산란 현미경에 의해 해결된다 (a) 및 (b). 이러한 집합체의 크기는 여러 가지입니다 &# 181; m, 소각 X 선 / 중성자 산란 또는 종래의 광 산란 기법 중 하나에 의해 얻어 질 수있다. 이 시스템을 사용하여 시간 – 분해 측정 온도 변화시 응집 공정에 관한 정보를 제공한다.

동적 광 산란 현미경의 단점은도 3에 도시되어있다. LCST 아래의 결과를, 시간 상관 함수 강하게 먼지 존재하는 미량 (도 3의 검은 선)에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 시간 상관 함수도 1.0의 순서에 상관 회 완전히 소멸하지 않는다. 이 장치는 (약 1.0 μm의) 조사 볼륨 통상 동적 광산란 장치 (약 100 μm의)과 그 조사보다 훨씬 작기 때문이다. 산란광의 강도가 약한 경우에는, 그러한 신호들에 의해 야기 된 것과 같은 잡음에 의해 가려솔루션에 먼지 쇼핑몰 양. 크기의 일반적인 순서를 의미하지만 따라서,도 3의 (b)에 도시 된 세 개의 피크는 정량적 중요성을 가질 수 없다. 그런 약한 산란이 종래의 동적 광산란 장치에 의해 측정 할 수있다.

우리는 동적 광산란 현미경은 우리가 같은 설정으로 투명하고 혼탁 모두 샘플을 측정 할 수 있음을 증명하고있다. 샘플에서의 광로 길이가 짧기 때문에,이 기술은 탄소 나노 튜브 현탁액 ^(20)와 같은 강한 빛 흡수의 샘플에 적용될 수있다. 또한, 그 때문에 높은 공간 해상도로,이 기술은 생물 세포에 적용 할 수있다. 생물에의 응용의 경우,이 방법은 또한 형광 및 라만 이미징과 같은 다른 이미징 기술과 결합 될 수있다. 따라서, 우리는 동적 광산란 현미경 연구 분야의 넓은 범위에 대한 강력한 도구 믿는다.

Materials

N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%
cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Ar-Kr ion laser	Spectra-Physics	Stabilite 2018
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP