Mätning av partikelstorleksfördelning i grumliga lösningar genom dynamisk ljusspridning Mikroskopi

Summary

Ett protokoll för direkt mätning av partikelstorleksfördelning i koncentrerade lösningar med dynamisk ljusspridning mikroskopi presenteras.

Abstract

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Introduction

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protocol

1. Provframställning Rening av temperaturkänsliga monomerer Lös upp 20 g N -isopropylacrylamide (NIPA) i 100 ml toluen. Filtrera lösningen under sug för att ta bort damm. Blanda filtratet med 500 ml petroleumeter. Placera reaktionskärlet i ett is-vattenbad. Rör om lösningen tills monomererna utfälles (typiskt 30 min). Filtrera lösningen under sug för att erhålla de utfällda monomerer. Torka monomererna under reducerat tryck (100 Pa) över natten. Framställningen av den temperaturkänsliga polymerlösningen Degas 20 ml avjoniserat vatten under 1,0 min med användning av en membranpump. Upplös 780.8 mg av det renade NIPA i 9,5 ml avgasad och avjoniserat vatten. Placera reaktionskärlet i ett is-vattenbad. Skydda reaktionen frånljus genom att täcka anordningen med aluminiumfolie. Rör om lösningen försiktigt under 10 min samtidigt som ett måttligt flöde av Ar-gas försiktigt via en pipettspets fäst gascylindern med ett rör. Lägga 11,9 mikroliter av N, N, N ', N' tetrametyletylendiamin till lösningen via en mikropipett. Rör om lösningen under 1,0 minuter medan införa Ar gas, som nämns i steg 1.2.5. Under omröring av provet, lös upp 4,0 mg ammoniumpersulfat i 0,5 ml avgasad och avjoniserat vatten. Blanda provet lösningen (från steg 1.2.7) och ammoniumpersulfat-lösning (från steg 1.2.8). Rör om lösningen under 30 sekunder samtidigt införa Ar gas, som nämns i steg 1.2.5. Täck lösningen med aluminiumfolie och förvara den i kylskåp (4 ° C) över natten. Beredning av provmonteringar Placera 60 mikroliter av provlösningen (frånsteg 1.2.11) i en hålighet bild. Täck av lösningen med ett cirkulärt täckglas. Var noga med att inte fälla luftbubblor. Ta bort överflödig lösning med hjälp av en mikropipett och laboratorie våtservetter. Täta provet med lim. Låt limmet torka vid rumstemperatur (typiskt 6 h). Förbered en annan bild fylld med 0,1 vikt% polystyrenlatex (100 nm partikeldiameter) suspension genom att följa stegen 1.3.1-1.3.4. Detta objektglas används som en standard. 2. Partikelstorleksmätning med en Dynamic Light Scattering mikroskop Optimering av instrumentet Placera polystyrenlatex upphängnings slide (från steg 1.3.5) på scenen i inverterat mikroskop. Täckglaset sidan ska vara vänd nedåt. Placera en balk spjäll i framför detektorn (en lavinfotodiod och en autokorrelator). Applicera en laserstråle (solid-state laser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuerligvåg) till provet genom en objektiv (10 ×). En del av det reflekterade ljuset går genom en lansering spegel av mikroskopet och observeras av en CCD-kamera monterad vid sidoingången av mikroskop (Figur 1). Justera höjden på objektivet för att ställa in fokus på prov suspensionen genom att flytta höjden av objektiv från lägsta till högsta läge. Under detta förfarande är den reflekterade bilden fokuseras tre gånger: vid ytan av täckglaset, vid gränsytan mellan täckglaset och provet, och vid gränsytan mellan provet och hålet-objektglas. Ställa in brännpunkten mellan den andra och tredje punkter. Dämpa spridda ljusintensiteten genom att ändra lasereffekt. Införa det spridda ljuset in i detektorn genom att ta bort balken spjället framför detektorn. Denna enhet mäter tiden korrelation av ljusintensiteten. Ställ ett litet hål (φ = 50 pm) between mikroskopet och detektorn för att uppnå den konfokala verkan. Justera positionen av den nålhål för att maximera ljusintensiteten vid detektorn. Mät tiden korrelationsfunktion av spridda ljusintensiteten under 30 s genom att initiera driften av korrelatorn via en dator. Den uppmätta korrelationsfunktionen uttrycks ofta som g (2) (t) – 1 där t är korrelationstiden 4 och . Här, är I (t) det spridda ljusintensiteten vid tiden t och (•••) T är tidsmedelvärdesbildning. Avklingningstiden kommer att vara cirka 0,1 ms. Ställa in brännpunkten för att erhålla ett brett område för den initiala amplituden för tidskorrelationsfunktion (g (2) (t = 0) – 1). OBS: Den initiala amplitud påverkas starkt av mängden reflekterat ljus. Genom att flytta fokus bogseraard gränssnittet mellan täckglaset och provet, mängden reflekterat ljus ökar. För starka ljusspridare, såsom polystyrenlatex, kan den initiala amplituden ändras från 0 till 1. Det är emellertid svårt att inställa den initiala amplitud nära ett för mer vanliga polymerlösningar eftersom intensiteten hos det reflekterade ljuset är mycket högre än den hos det spridda ljuset. Applicera invers Laplace transformation (med hjälp av den begränsade legaliseringsprogram CONTIN 13,14) till den erhållna tidskorrelationsfunktionen att förvärva funktion storleksfördelning. I de fall där den initiala amplituden är inställd på mindre än 0,2, kommer fördelningen funktion av den hydrodynamiska radien visar en skarp topp runt 100 nm, som är två gånger den faktiska radien (se diskussionen för detaljer). provmätning Ställ scenen temperaturen till 25 ° C. Placera en bild framställd med poly-NIPA (PNIPA) solutjon (steg 1.3.4) på ​​scenen av mikroskopet. Mät tiden korrelationsfunktionen för den spridda ljusintensiteten genom att följa steg 2.1.4-2.1.8. Om den initiala amplituden är större än 0,2, justera brännpunkten för att göra den initiala amplituden av tiden korrelationsfunktion mindre än 0,2 genom att följa steg 2.1.9. En liten initial amplitud förenklar analysen. Uppsättningen som arrangera temperaturen till 35 ° C och vänta tills lösningen blir grumlig. Den lägre kritiska lösningstemperaturen (LCST) av PNIPA lösning är 32 ° C 15. Mät tiden korrelationsfunktionen genom att följa steg 2.1.4-2.1.8. Om möjligt, justera läget för brännpunkten för att göra den initiala amplituden av tiden korrelationsfunktion mindre än 0,2. För grumliga lösningar, deras ursprungliga amplituder tenderar att öka, eftersom intensiteten av det spridda ljuset ökar medan den hos det reflekterade ljuset förblir konstant. Applicera den inversa Laplace transformatipå de erhållna tidskorrelationsfunktioner för att erhålla storleksfördelningen funktioner. Notera att den faktiska storleken är halv det erhållna värdet i de fall där den initiala amplituden är mindre än 0,2.

Representative Results

Tidskorrelationsfunktionerna för spridda ljusintensiteten för en polystyren-latexsuspension (partikel radie: 50 nm) mättes vid olika brännpunkter, såsom visas i figur 2 (a). Dessa korrelationsfunktioner konverterades till de fördelningsfunktioner för den hydrodynamiska radien av den inversa Laplace-transformation (se Figur 2 (b) och (c)). Med användning av samma förfarande framställdes de tidskorrelationsfunktioner och fördelningsfunktioner för den hydrodynamiska radien för den PNIPA lösning erhölls vid 25 ° C och 35 ° C, respektive. Figurerna 3 (a) och (b) visar de tidskorrelationsfunktionerna för den spridda ljusintensiteten och de motsvarande storleksfördelningsfunktioner PNIPA lösning nedan (25 ° C) eller högre (35 ° C) LCST. De storleksfördelningsfunktioner erhölls genom den inversa Laplace transformation följt avkorrigering av den partiella heterodyn. Den genomsnittliga hydrodynamiska radien under LCST är flera tiotals nanometer, vilket är typiskt för polymerlösningar. I motsats, den hydrodynamiska radien ovanför LCST är ca 1,0 ^ m. Detta resultat är i linje med det faktum att lösningen är grumlig över LCST. De röda och blå linjer i figur 3 representerar storleksfördelningen av PNIPA erhållna lösningarna omedelbart efter och 20 minuter efter att lösningen blev grumlig, respektive. Figur 3 (b) visar tydligt tillväxten av aggregering. Figur 1. Schema för dynamisk ljusspridning mikroskop. Pinhole (PH), stråldelare (BS), polarisationsfilter (Pol) och lavinfotodiod (APD). Klicka här för att seen större version av denna siffra. Figur 2. Representativa resultat för en polystyrenlatex suspension. (A) Tid korrelationsfunktionerna för den spridda ljusintensiteten för polystyrenlatex suspensionen. Den nominella radien är 50 nm och koncentrationen är 0,1 vikt%. Två datamängder erhölls från olika spridningspunkter. (B), (c) Motsvarande storleksfördelningsfunktioner för polystyrenlatex suspensionen erhållen genom den inversa Laplace transformation av (a). Den röda linjen motsvarar tidskorrelationsfunktion vars initiala amplitud är ungefär 1,0, och den blå linjen motsvarar den med en initial amplitud som är ungefär 0,2. Den horisontella axeln beräknades utan (b) och (c) med tanke på effekten av partiell överlagring (PHD) när A << ; 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3. Representativa resultat för en PNIPA lösning. (A) Tid korrelationsfunktionerna för spridda ljusintensiteten för PNIPA lösning. (B) Motsvarande storleksfördelningsfunktioner för PNIPA lösning som erhålls genom den inversa Laplace transformation av (a). Den horisontella axeln beräknades med tanke på effekten av partiell överlagring för varje datamängd. Den svarta linjen representerar de data som erhölls vid 25 ° C. Den röda linjen representerar de data som erhölls strax efter det att lösningen blev grumlig (35 ° C). Den blå linjen representerar de data som erhållits efter en 20-min mätning av den röda linjen./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den initiala amplituden för tidskorrelationsfunktion beror i hög grad på den brännpunkt, såsom visas i fig 2 (a). Detta motsäger till synes det faktum att lösningen är homogen (med undantag för det tunna skiktet vid gränsytan) ^8. Denna variation i den initiala amplituden skrivs en variation i mängden av reflekterat ljus. Partiell heterodyn teori ¹⁶ förutsäger att den initiala amplitud, A, det spridda ljuset Intensitet, I _s, och det reflekterade ljusets intensitet, _Ir, uppfylla följande ekvation ¹

Denna ekvation visar att den större _Ir blir, blir den mindre A. Därför är ett minskas genom att ställa in fokalpositionen nära gränsytan. Den skenbara diffusion konstant D _A can erhållas genom att anpassa tidskorrelationsfunktion i fallet med monodispersa lösningar:

var . Här, n är brytningsindex för lösningsmedlet (vatten, 1,33), är θ det spridda vinkeln (180 °), och λ är våglängden för ljus (514,5 nm). Eftersom vi tillämpade bakåtspridning geometri, är värdet på q fast. Emellertid är denna punkt löses genom användning av olika ljusvåglängder. Observera att någon form av kontinuerlig våg laserkälla finns att konstruera DLS mikroskop. Tack vare den lilla bestrålad volym, samstämmighet faktor ¹⁷ uppskattas till mer än 0,99 och är försumbar. För polydispersa lösningar, är fördelningsfunktionen för D _A erhålls genom den inversa Laplace transformation. Partiella heterodyn theory förutspår också att D _A inte _är densamma som den faktiska diffusionskonstanten D. Dessa två diffusionskonstanter uppfyller följande ekvation:

Diffusionskonstanten D omvandlas till den hydrodynamiska radien R _h med hjälp _av Einstein-Stokes ekvation ^4. När A = 1, blir detta förhållande D _A = D. I detta fall är dataomvandlingsprocessen densamma som för den gemensamma dynamisk ljusspridning. Den röda linjen som visas i figur 2 (b) motsvarar detta fall. I motsats härtill blir detta förhållande D _A = 0,5 D på gränsen för A → 0. Därför är storleken uppskattas vara dubbelt så stor som den verkliga storleken när A är liten (i praktiken mindre än 0,2), såsom visas med den blå linje i figur 2 (b) </sTrong>. Om vi vet att A är signifikant liten, kan den horisontella axeln förskjutas, såsom visas i fig 2 (c). I princip kan vi omvandla D _A in D för godtyckligt värde på A. I praktiken är det dock bättre att ställa den initiala amplituden är mindre än 0,2, eftersom enkel approximation D _A ~ 0,5 D håller streck.

De framträdande dragen i dynamisk ljusspridning mikroskop teknik visades med hjälp av en PNIPA lösning. Konformation PNIPA under och över LCST har studerats med hjälp av små vinklar neutronspridning ^15,18. Däremot har dynamisk ljusspridning inte utnyttjats för analys av PNIPA ovanför LCST på grund av dess turbiditet ^19. Detta problem löses genom dynamisk ljusspridning mikroskop, såsom visas i figurerna 3 (a) och (b). Storleken på dessa aggregat är flera &# 181; m, som inte kan erhållas genom antingen liten vinkel X-ray / neutronspridning eller konventionella ljusspridningstekniker. Tidsupplösta mätningar med användning av detta system ger information om aggregering processen under temperaturändring.

Nackdelen med den dynamiska ljusspridningsmikroskop illustreras också i figur 3. För resultatet under LCST är tidskorrelationsfunktion påverkas starkt av den mycket lilla mängden av damm som finns (de svarta linjerna i fig 3). Till exempel ser tidskorrelationsfunktionen inte förfalla helt, även med korrelationstider i storleksordningen 1,0 s. Detta beror på att volymen bestrålas med denna apparat (approximativt 1,0 ^ m) är betydligt mindre än den bestrålade med den vanliga dynamisk ljusspridning apparat (cirka 100 ^ m). I de fall där intensiteten av spritt ljus är svag, signalen skymd av bruset, såsom det som orsakas av sköpcentret mängder damm i lösningen. Därför kan de tre topparna som visas i Figur 3 (b) inte har kvantitativ betydelse även om den allmänna ordningen i storlek är meningsfull. Notera att en sådan svag spridare kan mätas genom en konventionell dynamisk ljusspridning apparat.

Vi har visat att dynamisk ljusspridning mikroskop kan vi mäta både öppna och grumliga prover med samma inställningar. Eftersom den optiska väglängden i proven är kort, kan denna teknik användas till starka ljusabsorberande prover, såsom Nanorör suspensioner ^20. Dessutom, på grund av dess höga rumsliga upplösning, denna teknik kan tillämpas på biologiska celler. För dess tillämpning till biologi, kan denna metod också kombineras med andra avbildningstekniker, såsom fluorescens och Raman avbildning. Således tror vi att den dynamiska ljusspridnings mikroskop är ett kraftfullt verktyg för ett brett spektrum av forskningsområden.

Materials

N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%
cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Ar-Kr ion laser	Spectra-Physics	Stabilite 2018
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP