Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.
Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.
विकास विश्लेषण है कि आमतौर पर संयंत्र के वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया जाता है जीनोटाइप चुना गया विकास मतभेद और / या पर्यावरणीय कारकों के प्ररूपी प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए उपकरणों का एक सेट पर निर्भर करता है। वे पूरे संयंत्र के आकार और वजन माप या एक अंग है और विकास दर की गणना के विकास के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए शामिल हैं। अंग विकास सेलुलर स्तर पर कोशिका विभाजन और विस्तार से निर्धारित होता है। इसलिए, इन दोनों प्रक्रियाओं के विकास में विश्लेषण की मात्रा का ठहराव सहित पूरे अंग विकास 1 में अंतर को समझने की कुंजी है। नतीजतन, यह सेलुलर विकास मानकों को गैर-विशेष प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है कि निर्धारित करने के लिए एक उचित कार्यप्रणाली के लिए महत्वपूर्ण है।
विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण पहले से ही एक दृष्टिकोण अंग विकास मॉडल 2 के विकास के लिए एक शक्तिशाली ढांचा उपलब्ध कराने के रूप में स्थापित कर दिया गया है। तकनीक रैखिक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया गया है,ऐसे Arabidopsis thaliana जड़ों और monocotyledonous पत्तियों के रूप में, लेकिन यह भी इस तरह के द्विबीजपत्री पत्ते 3 के रूप में गैर रेखीय सिस्टम, के लिए। आजकल, इस पद्धति तेजी से अध्ययन करने के लिए कैसे आनुवंशिक, हार्मोनल, विकास के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और पर्यावरणीय कारकों कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार (तालिका 1) को प्रभावित करती है। इसके अलावा, यह भी एक रूपरेखा अपनी अंतर्निहित, जैव रासायनिक आणविक, और शारीरिक नियमों (तालिका 2) के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं से जोड़ने के लिए प्रदान करता है, हालांकि सीमाओं तकनीक (जैसे, मेटाबोलाइट कि संयंत्र सामग्री की उच्च मात्रा की आवश्यकता के लिए अंग के आकार और स्थानिक संगठन द्वारा लगाया जा सकता है माप, प्रोटिओमिक्स, आदि)।
इस तरह के मक्का (Zea mays) पत्ती, के रूप में monocotyledonous पत्ते, रैखिक प्रणालियों जो कोशिकाओं सिरे की ओर पत्ती के आधार से स्थानांतरित करने का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमिक रूप से विभज्योतक और बढ़ाव क्षेत्र से गुजर परिपक्व तक पहुँचने के लिएक्षेत्र। यह यह विकास 4 के स्थानिक पैटर्न की मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाता है। इसके अलावा, मक्का पत्ते बड़े विकास क्षेत्र (विभज्योतक और बढ़ाव जोन कई सेंटीमीटर 5 फैले) और अन्य संगठनात्मक स्तर पर अध्ययन के लिए संभावनाओं प्रदान करते हैं। यह कोशिका विभाजन और विस्तार, आणविक तकनीक, शारीरिक माप, और कोशिका जीव विज्ञान के दृष्टिकोण (तालिका 2) की एक श्रृंखला के माध्यम से विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण द्वारा मात्रा को नियंत्रित (ख्यात) विनियामक तंत्र की जांच के लिए अनुमति देता है।
यहाँ, हम monocot पत्तियों में एक विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सबसे पहले, हम कैसे पत्ती अक्ष के साथ स्थिति और कैसे विज्ञान सम्बन्धी मापदंडों की गणना करने के एक समारोह के रूप में दोनों कोशिका विभाजन और सेल बढ़ाव का एक उचित विश्लेषण का संचालन करने के लिए समझाना। दूसरे, हम यह भी पता चलता है कि यह कैसे नमूना डिजाइन के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम दो मामलों पर चर्चा: उच्च संकल्प नमूना एकडी ध्यान केंद्रित नमूने, सुधार डेटा व्याख्या और समय / पैसे की बचत, क्रमशः सक्षम करने से।
तालिका 1. विज्ञान सम्बन्धी का अवलोकन कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार की मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों का विश्लेषण करती है।
अंग | संदर्भ |
monocotyledonous पत्ते | 16, 20, 21, 22 |
जड़ सुझावों | 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 |
द्विबीजपत्री पत्ते | 21, 30, 31 |
शिखर विभज्योतक गोली मार | 32 |
तालिका 1. विज्ञान सम्बन्धी का अवलोकन कोशिका विभाजन और विभिन्न अंगों में विस्तार की मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों का विश्लेषण करती है।
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-पेज = "1">तालिका 2 आण्विक स्तर पर उनके विनियमन के लिए विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण द्वारा मात्रा सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच लिंक। विभिन्न प्रजातियों और अंगों में जैव रासायनिक और आणविक assays से परिणाम के लिए सेलुलर प्रक्रियाओं की मात्रा का ठहराव जोड़ने विभिन्न अध्ययनों के संदर्भ। Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyde (एमडीए), cyclin निर्भर kinases (CDK)। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मक्का के पत्तों पर एक पूर्ण विज्ञान सम्बन्धी विश्लेषण पत्ती विकास के सेलुलर आधार के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है और कुशल नमूना रणनीति के डिजाइन के लिए अनुमति देता है। हालांकि प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए वीए एंटवर्प विश्वविद्यालय से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; फ्लेमिश विज्ञान फाउंडेशन (FWO, 11ZI916N) केएस करने से पीएचडी फैलोशिप; FWO (G0D0514N) से परियोजना अनुदान; एक ठोस अनुसंधान गतिविधियों (गोवा) अनुसंधान अनुदान, एंटवर्प विश्वविद्यालय के अनुसंधान परिषद से "पत्ता Morphogenesis का एक सिस्टम्स बायोलॉजी दृष्टिकोण"; और Interuniversity आकर्षण डंडे (IUAP सातवीं / 29, मंगल), GTSB हान Asard, Bulelani एल Sizani और Hamada AbdElgawad को बेल्जियम के संघीय विज्ञान नीति कार्यालय (BELSPO) से "मक्का और Arabidopsis रूट और विकास को गोली मार" सभी वीडियो के लिए योगदान दिया ।
Pots | Any | Any | We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot. |
Planting substrate | Any | Any | We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study. |
Ruler | Any | Any | An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants. |
Seeds | Any | NA | Seeds can be ordered from a breeder. |
Scalpel | Any | Any | The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
15 ml falcon tubes | Any | Any | The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid. |
Eppendorf tubes | Any | Any | The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution. |
Gloves | Any | Any | Latex gloves, which protect against corrosive reagents. |
Acetic acid | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3 |
Absolute ethanol | Any | Any | CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion |
Lactic acid >98% | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1 |
Sodium chloride (NaCl) | Any | Any | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Any | Any | CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3 |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) | Any | Any | This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract. |
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Any | Any | Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation. |
Ice | Any | NA | The DAPI solution has to be kept on ice. |
Fluorescent microscope | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length. | |
Microscopic slide | Any | Any | |
Cover glass | Any | Any | |
Tweezers | Any | Any | Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
Image-analysis software | Axiovision (Release 4.8) from Zeiss | NA | The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well. |
Microscope equipped with DIC | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths. | |
R statistical analysis software | R Foundation for Statistical Computing | NA | Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/ |
R script | NA | NA | We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC. Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows. |