Introduction
成長の分析は、一般的に環境要因への遺伝子型決定の成長の違いおよび/または表現型の応答を記述するために、植物の科学者によって使用されている一連のツールに依存します。彼らは、サイズと重量植物全体または器官の測定と成長の基礎となるメカニズムを探求する成長率の計算を含みます。臓器成長は細胞分裂および細胞レベルで膨張することによって決定されます。そのため、成長中のこれらの2つの方法の定量化を含めて、全体の臓器の成長1の違いを理解する鍵と分析しています。これにより、非専門の研究所によって使用することが比較的容易である細胞の成長パラメータを決定するための適切な方法を有することが重要です。
キネマティック解析はすでに臓器成長モデル2の開発のための強力なフレームワークを提供するアプローチとして確立されています。技術は線形システム用に最適化されました、このようなシロイヌナズナの根と単子葉植物の葉などが、また、このような双子葉葉3のような非線形システムのため。今日では、この方法はますますどの遺伝子、ホルモン、発達研究するために使用され、環境要因が、様々な器官（ 表1）に細胞分裂および増殖に影響を与えます。制限は、植物材料のより高い量を必要とする技術（ 例えば、代謝産物のための器官の大きさ及び空間的構成によって課すことができるが、また、それはまた、その基礎となる生化学分子、および生理学的規則（ 表2）に細胞プロセスをリンクするためのフレームワークを提供します測定、プロテオミクス、 など ）。
例えば、トウモロコシ（ トウモロコシ ）の葉、単子葉葉は、順次成熟に到達するために分裂組織と伸びゾーンを通過し、細胞が先端に向かって葉の基部から移動する線形システムを表しますゾーン。これは、成長4の空間パターンの定量的研究のための理想的なモデルシステムになります。また、トウモロコシの葉は、大きな成長ゾーン（数センチメートル5に及ぶ分裂組織と伸びゾーン）を持っているし、他の組織レベルでの研究の可能性を提供します。これは、分子技術、生理学的測定、および細胞生物学のアプローチ（ 表2）の範囲で運動学的分析により定量化し、細胞分裂と拡張を制御する（推定）調節機構の調査を可能にします。
ここでは、単子葉植物の葉に運動学的解析を行うためのプロトコルを提供します。まず、葉軸に沿った位置とどのように運動学的パラメータを計算するの関数として細胞分裂と細胞伸長の両方の適切な分析を行う方法について説明します。第二に、我々はまた、このサンプリングの設計のための基礎として使用することができる方法を示します。高解像度のサンプリングAN：ここでは、2例を議論しますdはそれぞれ、改善されたデータの解釈と時間/お金の節約を可能にする、サンプリングを集中しました。
動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。
| 器官 | 参照 |
| 単子葉植物の葉 | 16、20、21、22 |
| 根の先端 | 2、23、24、25、26、27、28、29 |
| 双子葉植物の葉 | 21、30、31 |
| 頂端分裂組織を撃ちます | 32 |
動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。
分子レベルでそれらの調節に運動学的分析によって定量化細胞プロセスの間に、表2のリンク。様々な種及び臓器における生化学的および分子アッセイからの結果に細胞プロセスの定量化を結ぶ様々な研究への参照。キシログルカンendotransglucosylase（XET）、マロンジアルデヒド（MDA）、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
注：運動学的分析のための以下のプロトコールは、定常状態の成長中の葉にのみ有効です。これは、数日間6の期間中に安定した葉の伸び率とセル長と葉の拡大の空間パターンを意味します。
1.植物の成長と葉の伸び率の測定（LER）
- 定常状態の成長の葉や関心の発達段階を選択してください。
注：同一の軸上に連続した葉に類似の空間パターンを意味し、定常状態の成長および繰り返し成長の差があります。苗の成長の初期段階では、連続した葉は、通常、成長ゾーン7の大型化にますます速くによる成長します。少数の高い葉の位置が同様の成長パターン8を持つことができますが、これは調査中での処理によって影響を受ける可能性がある過渡的な段階です。行及びTRとを比較することが重要ですそれは異なる時間で開発することができるにもかかわらず、厳密に同じ葉位にeatments。でも一定の伸び率で、成長率プロファイルは、必ずしも異なる発生段階で同じではありません。したがって、典型的には、出芽後の日数によって定義された同じ発達段階8で葉を分析することが重要です。 - 単子葉植物で葉の成長の完全な運動学的分析を実行するには、成長の部屋で制御された条件下で各治療と遺伝子型のため、少なくとも15植物を育てます。
- 当時関心の葉は、（周囲の葉の渦巻きから出現）が表示され、葉が完全に展開されるまで（ 図1I）定規で毎日葉の長さの測定を開始します。葉長、葉の先端に土壌レベルからの長さを意味します。これは、その成長を変えるかもしれないので、破損したり、葉を傷つけないように注意してください。
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図1：トウモロコシの葉の運動学的分析の概略関心の葉は、葉の伸長率（LER）を計算するために3日間連続定規で測定されます。その後、葉を収穫し、三センチセグメントが分裂組織のサイズを決意するために使用されます。これは、DAPI染色後の最も遠位の有糸分裂の図をベースまでの長さを測定することによって行われます。 （A）増殖性有糸分裂像の実施例、（B）造形有糸分裂像。ミッド静脈の反対側の葉の基部から最初の11センチセル長測定のための1001年センチのセグメントを切断するために使用されています。これらの測定は、成熟細胞の長さ（L マット ）および分裂組織（ リットルDIV）を残して、細胞の長さを決定するように機能するセルの長さのプロファイルを作成するための基礎を提供します。ザ
2.収穫
- 関心（ 例えば、出芽後三日目）の発達段階では、少なくとも5つの代表的なPを選択運動学的分析を実施する上でバッチからlants。最後の葉の長さを決定するために、ステップ1.3で説明したように、植物の残りの部分を測定続けます。
- 植物の地上部分をカットします。無傷の分裂部分を維持するために、（ 図1II）の根にできるだけ近いを切りました。
- 外側の葉から出発して、静かにそれらを一つずつをアンロールすることにより、関心の葉までのすべての葉を削除します。必要に応じて、葉を分離するためにベースからいくつかの余分なミリメートルを削除します。また興味深いの葉（ 図1iii）で囲まれた頂点と小さな葉を取り除きます。
- 中間静脈の一方の側にベースから出発し、3センチセグメントを切断し、3を充填した1.5 mlの試験管に保存：1（V：V）無水エタノール：酢酸溶液（注意：手袋を着用する）に数ヶ月に24時間のアップのために4℃（ 図1iv）。このセグメントは、後に分裂組織の長さを決定するために使用されます。
- から静脈の反対側は、ベースから11センチメートルセグメントをカットし（ 図1 V）および顔料（ 図1のvi）を除去するために、少なくとも6時間、4℃で無水エタノールを充填した15mlチューブに入れてください。
注：その後、（説明を参照）セル長プロファイルを決定するためにのみ最初の10センチ使用しています。 - 少なくとも24時間（ 図1vi）、4℃での洗浄の別のラウンドのために無水エタノールを更新。
- 最後に、純粋な乳酸と無水エタノールに置き換えて（注意：手袋を着用）クリーニングと保管のために4℃で24時間、またはさらに使用する（ 図1vi）まで。
3.分裂組織の長さの測定
- 50 mMの塩化ナトリウム（NaCl）、5mMのエチレンジアミン四酢酸を含有するリンス緩衝液を調製する（EDTA;注意：手袋を着用）および10mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（TRIS-HClを、pHが7）。
- セクション2.4から3センチメートルセグメントを取るので、20分（ 図1vii）用のバッファでそれをのk。
- 待っている間、氷上、暗所でそれを維持する、を1μg/ mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色溶液を調製するためにすすぎバッファを使用。
- DAPI染色溶液中で2~5分間分裂組織セグメントを配置することによって核を染色します。氷の上で、暗い（ 図1vii）で働いています。
- すぐに顕微鏡ガラス上のセグメントをマウントし、カバーガラスで覆うことにより、蛍光シグナルを確認してください。基礎となる細胞層はいけないしながら、表皮細胞は、蛍光を示すべきです。
- 染色が十分でない場合、いくつかの余分な分間DAPI染色溶液中にバックセグメントを入れます。
- 染色を停止するには、カバーガラスと顕微鏡スライドとカバーにバッファをすすぐのドロップセグメントをマウントします。
- 約1,000表皮の可視化を可能にする、20X倍率でのUV蛍光を備えた顕微鏡を使用してくださいアル細胞を一度に。セグメント全体でスクロールして、増殖性有糸分裂像（中期、後期、終期、および細胞質分裂）を探し、途上気孔（ 図1viii）の造形細胞分裂を回避する9。最も遠位の有糸分裂の数字が配置されている場所を定義します。
- 葉のベースと最も遠位の表皮の有糸分裂の数字の間の距離を測定することによって、分裂組織の長さを決定します。画像フレームの全長を測定するために、画像解析ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。
- （葉の根元から最も遠位の有糸分裂の図のように）完全な分裂組織の長さをカバーするフレームの数をカウントし、完全な分裂組織長（ 図1ix）を得るために、1フレームの長さによって、この数を乗算します。
4.セル長プロフィール
- 乳酸（ステップ2.5）に格納されているセグメントを取り、ベンチに慎重に置きます。セグメントのウィットをカット1センチメートル各（ 図1×）の10セグメントにおけるヘクタールメス。
- 乳酸の小滴に顕微鏡スライド上の連続した葉切片をマウントします。一貫向軸または背軸面を上のいずれかに直面することを確認します。原理的には、特定の側には優先順位がありません。
- 葉の基部から始まって、セグメントを分析するために微分干渉コントラスト（DIC）光学系を備えた顕微鏡を使用してください。一貫して同じ細胞型を選択するために画像解析ソフトウェアを用いて気孔ファイルに直接隣接したファイル内の少なくとも20の反復の表皮細胞の長さを測定します。
- セグメント（セグメントで十分あたり4箇所）のそれぞれに沿って等間隔の位置でこれを行い、そして葉（ 図1xi）を通じて、各測定のための対応する位置を書き留めてください。
- 局所多項式平滑pを用いて、葉軸に沿って各ミリにおける平均セル長を決定しますrocedure、R-スクリプト（;補足ファイル1 図1xii）に実装されています。
注：R-スクリプトはスムージングの増加に伴う一連のデータを提供します。必要な平滑化の量は、ある程度任意であり、理想的にはちょうど地元のノイズを除去するが、全体的な曲線に影響を及ぼさないはずです。一つの実験内の全てのサンプルについてスムージングの同じ量を使用してください。 - 植物間の各位置でのセル長を平均葉の軸に沿った細胞の長さプロファイルを作成するための標準誤差を計算します。
機構パラメータの5.計算（補足ファイル2を参照してください）
- （ステップ1.3と同様に、例えば、24時間、）は、2つの連続する時点間葉の長さの変化を取得し、時間間隔で割ることにより、LERを計算します。
- 細胞が成熟したCEの95％に達する、ベースからの位置の遠位に対応する成長ゾーン（LのGZ）の長さを計算します平滑化セル長プロファイル上のLL長。
- その位置（ 図2）は、次の平滑セル長分布の各位置のすべてのセルの長さの平均の95％を取ります。
- 各位置で計算された95％の細胞の長さを有する平滑細胞長（ステップ4.4）を比較します。 （;補足データ2を図2を参照）、葉の基部から開始し、成長ゾーンは、実際のセルの長さは、次のセルの長さの95％に等しい位置で終了します。
図2：成長ゾーンの終了を決定する分裂組織：赤い星で示す位置で、実際のセルサイズは、95％（赤点線）よりも小さい全てのセルの平均セルサイズのこの位置以下の（赤色の固体ライン）。成長ゾーン（LのGZの終わり;、abで示されていますLUEスター）は、この位置以下のすべてのセルの平均セルサイズ（青の実線）の95％（点線青線）は、実際のセルサイズに等しい位置しています。分割領域（D）、延伸ゾーン（E）、および成熟領域（M）。破線の矢印は、地元の大きさや葉の先端までの基礎の位置から移動した葉の先端部全体の平均サイズの95％の間の収束を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 成長ゾーン（LのGZ）の長さと分裂組織の大きさ（;ステップ3で決定したLのマー ）との差として伸長領域（L エル ）の長さを計算します。
- 成熟したゾーン内の平均セル長として成熟細胞の長さ（L マット）を計算します 。
- 取得するには、l マットによってLERを割り細胞産生速度（P）。
- NのGZとN マーとの差である伸長領域（N エル ）のセルの数を計算します。分裂組織（N マー ）での細胞の数は、分裂組織に対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。成長ゾーン（NのGZ）中の細胞の数は、成長ゾーンに対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。
- P / Nのマーとして平均細胞分裂速度（D）を計算します 。細胞周期の継続時間（T c）は 、LN（2）/ Dに等しいです。
- PでN エルを分割することにより伸長領域（T エル ）で時間を計算します。分割ゾーン内の時間は、ログ2（N マー ）* T cを等しくなります。分裂組織を離れる細胞の長さ（L divの ）分裂組織の終わりに平滑化セル長プロファイルからセル長に等しいです。
- LN（ リットルマット ）-ln（ リットルdivの ）] / T エル ：平均以下の式を用いて細胞増殖率（R エル）を計算します 。
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Representative Results
ここで、我々は彼らの葉の成長の面ではよく水やり植物（対照、54％土壌水分量、（SWC））と乾燥ストレス条件に付し植物（干ばつ、34％SWC）間の比較を示します。すべての植物は、制御された条件（16時間の日/ 8時間の夜、25℃/ 18℃の昼/夜、300-400μEm-2秒-1光合成有効放射（PAR）の下で成長チャンバー中で増殖させた。干ばつ正しいSWCに達した後、さらに維持したまで。予備研究では、それは五葉が、このストレス条件で出現し、開発した最初の1であることが規定された水を源泉徴収することによって確立された。したがって、それはの葉に選ばれました干ばつストレスを受けた植物の関心。最終的な葉の長さ（LL）が低いLER（ 表3）によるものであっただけでなく、水やり植物の一つ、40％より低かった。リーの細胞の基礎を理解するためにF成長応答、我々は運動学的分析を行いました。全体として、葉の伸長率は、伸長ゾーン（ 図3）で決定された分裂組織での細胞産生の機能および成熟細胞の大きさです。したがって、葉の短縮は、1つまたは複数のこれらのパラメータの両方への影響に起因する必要があります。我々の結果は、成熟細胞の長さ（L マット）は影響を受けなかったが、細胞産生率（P）が 71％（ 表3）に減少したことを示す。L マットは、分裂組織を残してセルの長さ（LのDIV）に依存します、これらの細胞は伸長領域（T エル ）に費やす時間、および相対細胞増殖率（R エル ）。 R ELは干ばつで67％減少した一方で何の効果は、 リットルdivのために認められませんでした。この効果はほぼ同じリットルマットをもたらしたT エル 、の三倍で補償されました</サブ>制御条件のように。細胞産生速度の減少は、より低い平均細胞分裂速度（D）と小さく分裂組織中の細胞の数（N マー ）の両方によって引き起こされる、順番に、ありました。分裂組織（L マー ）の長さが大きく影響を受けなかった成長ゾーン（LのGZ）の長さとは対照的に減少しました。結論として、これらの結果は、この場合、細胞数は、細胞の大きさとは異なり、葉の大きさを決定する際に重要な役割を持っていたことを示しています。
| 機構パラメータ | C言語 | D | ％チェンジCD | p値 |
| LL | 727±15 | 436±23 | -40 | 0.000 |
| LER（MM / H） | 2.8±0.1 | 0.8±0.0 | -73 | 0.000 |
| リットルマット （ミクロン） | 140±3 | 130±6 | -7 | NS |
| P（細胞/ H） | 20±1 | 6±0 | -71 | 0.000 |
| D（セル・セル-1・時間-1） | 0.028±0.003 | 0.010±0.001 | -63 | 0.000 |
| T cの（時間） | 26±3 | 71±7 | 173 | 0.000 |
| T div要素 （時間） | 249±27 | 656±71 | 164 | 0.000 |
| L マー （MM） | 15±1 | 11±1 | -25 | 0.010 |
| N マー | 740±31 | 590 + 20 | -20 | 0.000 |
| R・エル （ミクロン・ミクロン | 0.043±0.002 | 0.014±0.001 | -67 | 0.000 |
| リットルdivの（ミクロン） | 24±2 | 23±2 | -4 | NS |
| T・エル （時間） | 42±2 | 125±11 | 199 | 0.000 |
| N・エル | 844±54 | 735±65 | -13 | NS |
| L Gが Z（mm）の | 68±1 | 61±5 | -11 | NS |
| N個のG zの | 1584±33 | 1326±66 | -16 | 0.010 |
の五葉の定常成長中の細胞分裂および細胞増殖の 表3 運動学的解析乾燥ストレスにさらさよく水やり植物や植物データSE±平均値である。（LLのために、N = 5：N = 10）。スチューデントのt検定を統計分析に用いました。パラメータ：葉の長さ（LL）、葉の伸長率（LER）、成熟細胞の長さ（L マット ）、細胞産生速度（P）、細胞分裂速度（D）、細胞周期の継続時間（T c）が 、時分割ゾーンで（ T のdiv）、分裂組織の長さ（L マー ）、分裂組織（N マー中の細胞数）、相対的な細胞伸長率（R エル ）、分裂組織（ リットルのdiv要素を残して細胞）の長さ、伸びゾーンの時刻（T EL）、延伸ゾーン（N EL）、成長ゾーンの長さ（LのGZ）、成長ゾーン内のセルの数（NのGZ）、十分に散水条件（C）、干ばつストレス中の細胞の数（ D）、 dは有意ではない（NS）。
図 3： 機構パラメータとの関係 、最終的な葉の長さ（LL）が順番にセル生産（P）および成熟細胞の長さ（L マット ）に依存リーフ伸び率（LER）、に依存します。分裂組織（N マー ）中の細胞数とDの逆数として細胞分裂速度（D）と共に、細胞周期の継続時間（T c）が用いて、Pを決定します。分裂組織を離れる細胞の伸長領域（T エル ）、長さ（L divの ）における時間、および相対細胞増殖率（R エル）は、成熟細胞の長さ（L マット）を決定します 。伸長ゾーン（N EL）中の細胞の数。.jove.com /ファイル/ ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
臓器の成長の詳細な分析としての用途に加えて、運動学的分析は葉の成長ゾーンの局在化のマップを提供し、分子および生化学的解析4,10,11のための帯下の分解能でサンプリングすることができます。一例として、 図4（a）は 、上記と同じ条件に供植物中のトウモロコシの葉の成長ゾーンに沿ったマロンジアルデヒド（MDA）の定量化を示します。 MDAは、ROSによって脂質過酸化の間に形成された二次代謝産物であり、酸化的損傷12のレベルを反映しています。 MDAは、成長勾配11に沿って濃度変化の分析を可能にし、そのベースから出発して、葉のすべてのセンチメートルで測定しました。乾燥処理は、40％の葉の短縮、発達ゾーンの長さの原因として（メリコントロールの茎、伸長領域、および成熟したゾーン）植物が干ばつに同じゾーンの長さと一致しませんでした（ 図4B）の植物を強調しました。 図4Bに見られるように、コントロール植物における分裂組織は、約1.5センチメートルの長さであり、伸長ゾーンは、リーフベース1.5から6.8センチメートルのスパン。ストレスを受けた植物では、分裂組織は0〜1.1センチ、1.1 6.1センチメートルから伸びゾーンから局在していました。 MDAレベルと全成長ゾーンは、コントロール処置と比較干ばつストレス植物において増加しました。運動学的分析の助けを借りて、我々はMDAの含有量は、特に両方の制御や干ばつの治療のための成熟したゾーンで増加したと結論付けることができます。発達ゾーンのサイズを知らなくても、私たちは、乾燥ストレス下で、と結論だろう、対照植物よりも早く発達段階におけるMDA含有量が増加、それは考慮に起因ゾーンのシフトをとらないように間違っているだろうトンへ彼の葉の短縮。したがって、生化学的測定の前に運動学的分析を実行するデータを正しく解釈するために非常に重要でした。
図4： 高解像度の生化学的測定値の例と集中的分析のためのサンプリング （A）マロンアルデヒド（MDA）成長した植物の（10セグメントに分割）トウモロコシの葉の成長ゾーンに沿って測定された濃度ではよく骨抜き状態や植物の干ばつに供しました。治療10。データは、SE±平均値である（N = 5）。双方向ANOVAを統計解析として使用し、p値は、次のグラフのパネル（ファクタ：干ばつ（d）及びセグメント（複数可））に示されています。 FW：新鮮重量。 （B）制御で異なる成長ゾーンと干ばつストレスを受けた植物の可視化。分割領域（D）、延伸ゾーン（E）、および成熟したゾーン（M）。細胞は125倍に拡大しています。 （C）制御や干ばつ処理植物の細胞の長さのプロファイル。データは、SE±平均値である（N = 5）。 （D）制御や干ばつで処理した植物の両方でフォーカスされたサンプリングの違い。ブルーボックスは、両方の処置で同じ発達段階を比較するためのサンプリング位置を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
高解像度の研究で同じ発生ゾーンの比較可能性を提供することに加えて、運動学的解析は、同じ発達段階にある細胞を含む特定のゾーンのみのサンプルが採取されたより集中分析の基礎として使用することができます。まず、10℃で、微小セルの長さの測定値の平滑化により提供されるセル長プロファイルを比較しました制御や干ばつストレスを受けた植物の葉の基部からentimeters。 図4Cセル長プロファイルを使用して、我々は発達ゾーンの長さを決めることができ、また、制御や干ばつストレスを受けた植物の両方で成長率のダイナミクスに従うことができ、ことを示しています。これは、伸長（急な上昇の途中で）ゾーンと成熟したゾーン（高原の初め）で、若い成熟した細胞では細胞を増殖、（急な上昇の前に）分裂組織で増殖する細胞の特定のサンプリングを可能にしました。我々の結果は、干ばつに応答して、葉の短縮のために、これらのゾーンは、コントロールにし、ストレスを受けた植物には対応していなかった、ということを示しています。 、増殖拡大、および対照植物の若い成熟した細胞を採取するために、我々は、それぞれ、葉の基部から第一、第5、第9センチメートルを必要としました。しかし、ストレス植物において、これらのセグメントは、それぞれ、第1、第4、及び第8センチメートルに相当します。より焦点を絞ったこの種のサンプリングは、 など RNAシーケンシング、プロテオミクス、メタボロミクス、などより、面倒な高価な、または時間のかかる研究の場合に有用であることが証明されています
補足ファイル1：多項式平滑化手順のためのR-スクリプトは、 右のこのファイルをダウンロードするにはクリックしてください。
補足ファイル2：機構パラメータの計算は、 右のこのファイルをダウンロードするにはクリックしてください。
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Discussion
トウモロコシの葉の完全な運動学的分析は葉の成長の細胞基盤の決意を可能にし、効率的なサンプリング戦略を設計することができます。プロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの注意が次の重要なステップで推奨されている：分裂組織の長さの決意（ステップ3）が完了を必要とするため、（1）分裂組織に損傷を与えることなく、若い、同封の葉（ステップ2.3）を取り外すことが重要です分裂組織が存在することが可能です。いくつかの練習は、事前に必要になることがあります。 （2）分裂長決意は、有糸分裂像の解釈に基づいています。したがって、我々は一つの実験内で、同じ人がエグゼキュータによるバラツキを低減するためにこれらの測定を行うことをお勧めします。わずか10センチメートルは、実際のセルの長さの測定のために使用しても、セルの長さの測定（ステップ2.5）のためのセグメントを採取する際に、セグメントの縁がないがないため、（3）、11センチメートル含めることが重要ですtは常に完全にエタノールおよび/または乳酸に水没します。したがって、この余分センチは成長ゾーンの最初の10センチメートルのクリアを確実にします。 （4）最後に、正しいことを確認するために、すべての機構パラメータの結果を検査することが有用です。 表3には、例えば、干ばつストレスを受けた植物の細胞産生率（P）は 、他の言葉で、71％減少し、またはされた、Pの干ばつは、P 制御の0.29です。そして分裂組織中の細胞の数（N マー ; 20％; 図3）;細胞産生は、平均細胞分裂率（-63％D）に依存するため、次の出力を検証するために使用することができる：P（0.29）≈ N個のマー （0.8）×D（0.37）。同じことがLER = P XのI マットに適用することができます。
利用可能な機能に応じて、プロトコルは、いくつかのステップで変更することができます。 （1）よりA毎日のマニュアル葉の長さ測定のためのdvanced代替（ステップ1.3）は線速度変位トランスデューサに基づいています（のLVDT）13。その利点は、数分から秒までの範囲の、非常に高い時間分解能で測定を可能にすることです。 （2）サンプリング中に完全な成長ゾーンを含めることが重要です。しかし、環境条件、遺伝子型、種、および発育段階について検討が成長ゾーンの長さを変更することがあります。したがって、あなたの実験処理に応答して成長ゾーンの長さの第1の推定を行うことが有用です。このプロトコルは300-400μEm-2 s -1の（ - PAR光合成有効放射）で25℃/ 18℃（昼/夜）で成長した近交系B73に基づいています。 （3）蛍光を使用することなく、有糸分裂像（ステップ3.8）を可視化するために、Fuelgen汚れ14を適用することができます。 （4）データの平滑化はまた、5点資格を使用して、MS Excelの代わりにRで行うことができdratic「LINEST」関数15でフィッティング。
この技術の重要な制限は、全体の成長ゾーンは定常成長中に回収する必要があることです。光強度、温度、湿度の変動がリーフ伸び率16に影響を与えるため、定常状態の成長を確実にするために、植物は、理想的には、制御された成長条件下で成長させなければなりません。この理由のために、運動学的分析は、フィールド条件の下で成長した植物にはあまり適しています。別の欠点は、葉が、それは不可能、古い葉で囲まれた葉を検査することができている、出現する必要があるということです。最後に、プロトコルは少なくとも数センチメートルを包含する大きな成長ゾーンを有する単子葉植物種に適しています。小さい単子葉植物（ 例えば、のPoa、米）上の運動学的分析は、しかし、実現可能であるが、試料調製17,18にいくつかの変更を必要とします。
もう一つは、頻繁に使用します差動成長表現型を分析するためのDのアプローチは、古典的な増殖分析です。この分析は、プラント全体の相対的な成長率を定量化し、新たな光合成領域に、プラント19の他の部分に光合成由来の炭素の根本的な配分を決定します。運動学的解析は、しかしながら、細胞分裂および増殖の定量に基づく成長の表現型に連結されている基礎となる細胞プロセスのより詳細な理解を可能にします。また、それぞれの成長ゾーンの長さを決定する可能性が検討され、治療の影響を受けている特定の発達段階の葉軸に沿った分子の測定値の相関関係を可能にします。これは、データの解釈のために重要です。時間や予算とき、または特定の発達段階に興味が制限されると、この分析の結果は、分析に必要なサンプルの数を減らす、フォーカスされたサンプリングを可能にします。結論として、運動学的分析が可能にストレス応答の基礎となる細胞パラメーターと葉の成長の遺伝的変異の決意だと規制プロセス（ 表2）を上流側にそれらをリンクすることができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、VAへのアントワープ大学から博士課程の交わりによってサポートされていました。 KSへフランダース科学財団（FWO、11ZI916N）から博士課程の交わり。 FWO（G0D0514N）からプロジェクト助成金。協調研究活動（GOA）研究助成金、アントワープ大学の研究会から「葉の形態形成のシステムバイオロジーのアプローチ」。そして、大学間アトラクションGTSBハンAsard、Bulelani L. Sizaniと浜田AbdElgawadにベルギー連邦科学政策室（BELSPO）からポーランド（IUAP VII / 29、MARS）、「トウモロコシやシロイヌナズナ根と成長を撃つには、「すべてのビデオに貢献します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pots | Any | Any | We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot. |
| Planting substrate | Any | Any | We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study. |
| Ruler | Any | Any | An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants. |
| Seeds | Any | NA | Seeds can be ordered from a breeder. |
| Scalpel | Any | Any | The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| 15 mL falcon tubes | Any | Any | The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid. |
| Eppendorf tubes | Any | Any | The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution. |
| Gloves | Any | Any | Latex gloves, which protect against corrosive reagents. |
| Acetic acid | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3 |
| Absolute ethanol | Any | Any | CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion |
| Lactic acid >98% | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1 |
| Sodium chloride (NaCl) | Any | Any | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Any | Any | CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3 |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) | Any | Any | This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Any | Any | Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation. |
| Ice | Any | NA | The DAPI solution has to be kept on ice. |
| Fluorescent microscope | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length. | |
| Microscopic slide | Any | Any | |
| Cover glass | Any | Any | |
| Tweezers | Any | Any | Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| Image-analysis software | Axiovision (Release 4.8) from Zeiss | NA | The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well. |
| Microscope equipped with DIC | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths. | |
| R statistical analysis software | R Foundation for Statistical Computing | NA | Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/ |
| R script | NA | NA | We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC. Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author. |
References
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