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Análisis cinemático de la división celular y la expansión: La cuantificación de la base celular del crecimiento y el desarrollo en las zonas de muestreo Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Análisis del crecimiento depende de un conjunto de herramientas que se utilizan comúnmente por los científicos para describir la planta de genotipo determinado las diferencias de crecimiento y / o respuestas fenotípicas a factores ambientales. Incluyen mediciones de tamaño y peso de la planta entera o un órgano y los cálculos de las tasas de crecimiento para explorar los mecanismos subyacentes de crecimiento. el crecimiento de órganos se determina por la división celular y la expansión a nivel celular. Por lo tanto, incluyendo la cuantificación de estos dos procesos en el crecimiento de los análisis es clave para entender las diferencias en el crecimiento conjunto de órganos 1. En consecuencia, es fundamental contar con una metodología adecuada para determinar los parámetros de crecimiento celular que es relativamente fácil de usar por los laboratorios no especializados.

Análisis cinemático ya se ha establecido como un enfoque que proporciona un marco de gran alcance para el desarrollo de modelos de crecimiento de órganos 2. La técnica ha sido optimizado para sistemas lineales,como las raíces de Arabidopsis thaliana y las hojas monocotiledóneas, sino también para sistemas no lineales, tales como hojas dicotiledóneas 3. Hoy en día, esta metodología se utiliza cada vez para estudiar cómo genéticos, hormonales, de desarrollo, y los factores ambientales influyen en la división celular y la expansión en varios órganos (Tabla 1). Por otra parte, también proporciona un marco para vincular los procesos celulares a sus regulaciones bioquímicos, moleculares y fisiológicos subyacentes (tabla 2), aunque las limitaciones pueden ser impuestas por el tamaño del órgano y la organización espacial de las técnicas que requieren una mayor cantidad de material vegetal (por ejemplo, metabolitos mediciones, proteómica, etc.).

Hojas monocotiledóneas, tales como el maíz (Zea mays) hoja, representan sistemas lineales en los que las células se mueven desde la base de la hoja hacia la punta, pasando secuencialmente a través de la zona de meristemas y la elongación para llegar a la madurazona. Esto hace que sea un sistema modelo ideal para los estudios cuantitativos de los patrones espaciales de crecimiento del 4. Por otra parte, las hojas del maíz tienen grandes zonas de crecimiento (meristemas y zona de elongación que abarcan varios centímetros 5) y ofrezcan posibilidades para estudios en otros niveles de organización. Esto permite la investigación de las (supuestas) mecanismos reguladores que controlan la división celular y la expansión, cuantificado por análisis cinemático a través de una serie de técnicas moleculares, las mediciones fisiológicas, y métodos de biología celular (Tabla 2).

A continuación, ofrecemos un protocolo para la realización de un análisis cinemático en las hojas de monocotiledóneas. En primer lugar, explicamos cómo llevar a cabo un análisis adecuado de tanto la división celular y elongación celular como una función de la posición a lo largo del eje de la hoja y la forma de calcular los parámetros cinemáticos. En segundo lugar, también muestran cómo se puede utilizar como base para el diseño de muestreo. A continuación, se discuten dos casos: de alta resolución de un muestreod centró toma de muestras, lo que permite la interpretación de datos mejorada y el ahorro de tiempo / dinero, respectivamente.

Tabla 1. Resumen de los análisis cinemático métodos para la cuantificación de la división celular y la expansión en varios órganos.

Organo referencia
hojas de monocotiledóneas 16, 20, 21, 22
puntas de las raíces 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
hojas dicotiledóneas 21, 30, 31
disparar meristemo apical 32

Tabla 1. Resumen de los análisis cinemático métodos para la cuantificación de la división celular y la expansión en varios órganos.

Tabla 2. Relación entre procesos celulares cuantificados por el análisis cinemático para su regulación a nivel molecular. Las referencias a diversos estudios que relacionan la cuantificación de los procesos celulares con los resultados de los ensayos bioquímicos y moleculares en distintas especies y órganos. Endotransglucosylase xiloglucano (XET), malondialdehído (MDA), quinasas dependientes de ciclina (CDK). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

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Protocol

NOTA: La siguiente protocolo para el análisis cinemático sólo es válida para las hojas durante el crecimiento de estado estacionario. Esto implica una velocidad de alargamiento de la hoja estable y los patrones espaciales de longitud de la célula y la expansión en una hoja durante un período de varios días 6.

1. Crecimiento de las Plantas y mediciones de la hoja Elongación Rate (LER)

  1. Elija una hoja en el crecimiento de estado estacionario y una etapa de desarrollo de interés.
    NOTA: Hay una diferencia entre el crecimiento de estado estacionario y el crecimiento repetitivo, lo que implica patrones espaciales similares en las hojas sucesivas sobre el mismo eje. Durante las primeras etapas de crecimiento de las plántulas, hojas sucesivas en general crecen cada vez más rápido debido al aumento del tamaño de la zona de crecimiento 7. Aunque algunas posiciones de las hojas superiores pueden tener un patrón de crecimiento similar 8, esto es una fase transitoria que puede ser afectada por los tratamientos bajo investigación. Por tanto, es importante comparar las líneas y tr eatments estrictamente en la misma posición de la hoja, a pesar de que puede estar desarrollando en un momento diferente. Incluso a una velocidad de elongación constante, el perfil de la tasa de crecimiento no es necesariamente la misma en las diferentes etapas de desarrollo. Por lo tanto, es importante analizar las hojas en la misma etapa de desarrollo 8, por lo general definido por el número de días después de la emergencia.
  2. Para realizar un análisis cinemático completo de crecimiento de las hojas en monocotiledóneas, crecerá al menos 15 plantas para cada tratamiento y el genotipo bajo condiciones controladas en una cámara de crecimiento.
  3. En el momento de la hoja de interés aparece (la salida de la espiral de hojas circundantes), comenzar a medir la longitud de la hoja diaria con una regla hasta que la hoja está completamente expandido (Figura 1i). longitud de la hoja implica la longitud desde el nivel del suelo hasta la punta de la hoja. Tenga cuidado de no romper o dañar la hoja, ya que esto podría alterar su crecimiento.

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Figura 1:. Vista general esquemática de un análisis cinemático de hojas de maíz La hoja de interés se mide con una regla de tres días consecutivos para calcular la elongación de la hoja Rate (LER). A partir de entonces, la hoja se cosecha y un segmento de tres centímetros se utiliza para la determinación del tamaño de meristemo. Esto se hace mediante la medición de la longitud desde la base hasta la cifra mitótico más distal después de la tinción DAPI. (A) Los ejemplos de figuras de mitosis proliferativas y (B) mitosis formativos. Los primeros once centímetros de la base de la hoja en el otro lado de la mitad de la vena se utilizan para cortar diez segmentos de un centímetro para mediciones de la longitud de la célula. Estas mediciones proporcionan la base para crear el perfil de longitud de la célula, que sirve para determinar la longitud madura celular (l mat) y la longitud de las células que salen del meristemo (l div). los l estera se utilizan para calcular la tasa de producción de células (P), mientras que l div y L mer se utilizan para calcular el número de células en el meristemo (mer N). A su vez, P y N mer se utilizan para calcular la tasa media de la división celular (D), que es la inversa de la duración del ciclo celular (T c). Las flechas del mismo color indican los parámetros que se utilizan para calcular el parámetro siguiente en estas flechas. Barras de escala = 40 m. Números romanos se utilizan para referirse a los procedimientos experimentales específicos descritos en el protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. La recolección

  1. En la etapa de desarrollo de interés (por ejemplo, el tercer día después de la emergencia), elija al menos cinco representativa plantes del lote en el que para llevar a cabo el análisis cinemático. Continuar midiendo el resto de las plantas, como se explica en el paso 1.3 para determinar la longitud de la hoja final.
  2. Cortar la parte por encima del suelo de la planta. Para mantener la parte meristemático intacta, corte lo más cerca posible a las raíces (Figura 1ii).
  3. A partir de las hojas exteriores, retire todas las hojas hasta la hoja de interés por ellos desenrollar suavemente uno por uno. Si es necesario, retire unos pocos milímetros adicionales de la base para separar las hojas. También quite las hojas del ápice y pequeñas encerradas por la hoja de interés (Figura 1III).
  4. Cortar un segmento de 3 cm, a partir de la base en un lado de mediados de la vena, y almacenarlo en un tubo de 1,5 ml de ensayo lleno de 3: 1 (v: v) de etanol absoluto: solución de ácido acético (PRECAUCIÓN: Use guantes) a 4 ° C durante 24 horas hasta varios meses (Figura 1iv). Este segmento posterior se utiliza para determinar la longitud del meristemo.
  5. Desde elotro lado de la vena, cortar un segmento de 11 cm de la base (Figura 1 v) y colocarlo en un tubo de 15 ml lleno de etanol absoluto a 4 ° C durante al menos 6 horas para eliminar pigmentos (Figura 1 vi).
    NOTA: Más adelante, utilizar sólo los primeros 10 cm para determinar el perfil de longitud de la célula (ver Discusión).
  6. Renovar el etanol absoluto para otra ronda de limpieza a 4 ° C durante al menos 24 horas (Figura 1vi).
  7. Por último, sustituir el etanol absoluto con ácido láctico puro (PRECAUCIÓN: usar guantes) para la limpieza y el almacenamiento a 4 ° C durante 24 h, o hasta su uso posterior (Figura 1vi).

3. Las mediciones de longitud de meristemas

  1. Preparar un tampón de enjuague que contiene 50 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; PRECAUCIÓN: usar guantes) y 10 mM Tris (hidroximetil) aminometano-ácido clorhídrico (Tris-HCl, pH 7).
  2. Tome el segmento de 3 cm de la sección 2.4 y por loak en el buffer de 20 min (Figura 1vii).
  3. Mientras espera, utilizar el tampón de enjuague para preparar una solución de tinción 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de 1 g / ml, manteniéndolo en hielo y en la oscuridad.
  4. Tinción de los núcleos colocando el segmento de meristemo para 2-5 min en la solución de tinción DAPI. Trabajar en el hielo y en la oscuridad (Figura 1vii).
  5. Compruebe si hay señal de fluorescencia mediante el montaje de forma rápida el segmento en un vaso de microscopía y lo cubre con una cubierta de vidrio. Las células epidérmicas deben mostrar fluorescencia, mientras que las capas celulares subyacentes no debería.
  6. Si la tinción no es suficiente, poner el segmento de nuevo en la solución de tinción DAPI para algunos minutos adicionales.
  7. Para detener la tinción, montar los segmentos en una gota de disolución tampón de enjuague en un portaobjetos de microscopía y cubierta con una tapa de vidrio.
  8. Use un microscopio equipado con UV en la fluorescencia con un aumento de 20X, lo que permite la visualización de alrededor de 1.000 epidermislas células de Al a la vez. Desplazarse a lo largo del segmento y buscar figuras mitóticas proliferativas (metafase, anafase, telofase y citocinesis), pero evita la división celular formativo de los estomas en desarrollo (Figura 1viii) 9. Definir dónde se encuentra la figura mitótica más distal.
  9. Determinar la longitud del meristemo mediante la medición de la distancia entre la base de la hoja y el más figura mitótica epidérmica distal. Utilice un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para medir la longitud total de la trama de imagen.
    1. Contar el número de cuadros que cubren la longitud total de meristemas (desde la base de la hoja de la figura mitótica más distal) y multiplicar este número por la longitud de una trama para obtener la longitud completa de meristemas (Figura 1ix).

4. célula de cuerpo entero Perfil

  1. Tome el segmento que se almacena en ácido láctico (paso 2.5) y colocarlo cuidadosamente en el banquillo. Cortar el ingenio segmentosja bisturí en 10 segmentos de 1 cm cada una (Figura 1 x).
  2. Montar los segmentos de hojas sucesivas sobre un portaobjetos de microscopía en una pequeña gota de ácido láctico. Asegúrese de hacer frente a la consistencia, ya sea adaxial o el lado abaxial hacia arriba. En principio, no hay ninguna preferencia por un lado particular.
  3. Use un microscopio equipado con contraste de interferencia diferencial óptica (DIC) para analizar los segmentos, a partir de la base de la hoja. Medir con un software de análisis de imagen de la longitud de al menos 20 células epidérmicas de duplicados en archivos directamente adyacentes a los archivos de los estomas con el fin de seleccionar siempre el mismo tipo de célula.
    1. Para ello, en posiciones equidistantes a lo largo de cada uno de los segmentos (4 posiciones son suficientes por segmento), y asegúrese de anotar la posición correspondiente para cada medición a lo largo de la hoja (Figura 1xI).
  4. Determinar la longitud de la célula normal en cada mm a lo largo del eje de la hoja mediante el uso de una suavización polinómica local de pPROCEDIMIENTO, implementado en un R-escritura (Figura 1xii; Archivo 1).
    NOTA: La secuencia de comandos-R proporciona una serie de datos con el aumento de suavizado. La cantidad de suavizado requerida es algo arbitrario y lo ideal sería que acaba de quitar el ruido local, pero no afectará a la curva en general. Asegúrese de usar la misma cantidad de suavizado para todas las muestras dentro de un experimento.
  5. Promediar la longitud de la célula en cada posición entre las plantas y calcular el error estándar para crear un perfil de longitud de la célula a lo largo del eje de la hoja.

5. Los cálculos de los parámetros cinemáticos (véase la disposición complementaria 2)

  1. Calcular la LER tomando el cambio en la longitud de la hoja entre dos puntos de tiempo sucesivos (por ejemplo, 24 hr, como en el paso 1.3) y dividiéndolo por el intervalo de tiempo.
  2. Calcular la longitud de la zona de crecimiento (L gz) correspondiente a la posición distal de la base donde las células alcanzan 95% de su ce madurall longitud del perfil de suavizado longitud de la célula.
    1. Tomemos, por cada posición en el perfil smoothened longitud de la célula 95% de la media de todas las longitudes de células siguientes esa posición (Figura 2).
    2. Comparar las longitudes de células smoothened (paso 4,4) con la longitud de la célula 95% calculado en cada posición. Partiendo de la base de la hoja, la zona de crecimiento termina en la posición en la que la longitud de la célula actual es igual a 95% de las siguientes longitudes de células (Figura 2; véase los datos adicionales 2).

Figura 2
Figura 2:. La determinación de la final de la zona de crecimiento de meristemas: en la posición indicada con una estrella roja, el tamaño de celda actual es menor que 95% (línea roja punteada) del tamaño de celda promedio de todas las células siguientes esta posición (sólido de color rojo línea). El final de la zona de crecimiento (L gz; indicado con abLue estrellas) se encuentra en el 95% (línea punteada azul) del tamaño de celda promedio de todas las células después de esta posición (sólida línea azul) es igual al tamaño real de la celda. zona División (D), zona de elongación (E), y la zona maduro (M). Discontinuas flechas indican la convergencia entre el tamaño local y el 95% del tamaño promedio de la porción distal de la hoja cuando se pasa de las posiciones basales a la punta de la hoja. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Calcular la longitud de la zona de elongación (L el) como la diferencia entre la longitud de la zona de crecimiento (L gz) y el tamaño de meristemas (L mer; determinado en el paso 3).
  2. Calcular la longitud de la célula madura (l mat) como la longitud de celda promedio en la zona maduro.
  3. Divida la LER por l tapete para obtener eltasa de producción de células (P).
  4. Calcular el número de células en la zona de elongación (N el) como la diferencia entre N y N gz mer. El número de células en el meristemo (mer N) es igual al número acumulado de células situadas en los intervalos correspondientes a la meristemo. El número de células en la zona de crecimiento (N gz) es igual al número acumulado de células situadas en los intervalos correspondientes a la zona de crecimiento.
  5. Calcular la tasa de división celular promedio (D) como mer P / N. La duración del ciclo celular (T c) es igual a ln (2) / D.
  6. Calcular el tiempo en la zona de alargamiento (T el) dividiendo el N por P. El tiempo en la zona de la división es igual a log 2 (N mer) * Tc. La longitud de las células que salen del meristemo (l div)es igual a la longitud de la célula a partir del perfil smoothened longitud de la célula en el extremo del meristemo.
  7. Calcular la tasa promedio de expansión de células (R el) utilizando la fórmula siguiente: ln (l mat) ln (l div)] / T el.

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Representative Results

Aquí, se muestra una comparación entre las plantas bien regadas (control, el contenido de agua del suelo 54%, (SWC)) y plantas sometidas a condiciones de estrés hídrico (sequía, el 34% de CSA) en términos de su crecimiento de las hojas. Todas las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas (16 horas día / 8 horas por la noche, 25 ° C / 18 ° C día / noche, 300-400 μEm -2 s -1 de radiación fotosintéticamente activa (PAR). Las condiciones de sequía fueron establecidos por el agua reteniendo hasta que el SWC correcta se alcanzó y luego se mantuvo aún más. En un estudio preliminar, se definió que la quinta hoja es la primera en surgir y desarrollarse bajo esta condición de estrés. por lo tanto, fue elegida como la hoja de interés. la longitud de la hoja final (LL) de las plantas afectados por la sequía fue 40% más baja que la de las plantas bien regadas, lo cual fue debido a una menor LER (Tabla 3). para entender las bases celulares de la LEAf respuesta de crecimiento, se realizó un análisis cinemático. En general, la tasa de alargamiento de la hoja es una función de la producción de células en el meristemo y el tamaño de célula madura determinado en la zona de elongación (Figura 3). Por lo tanto, el acortamiento de la hoja debe ser debido a los efectos sobre uno o ambos de estos parámetros. Nuestros resultados muestran que mientras que la longitud de la célula madura (l mat) no se vio afectada, la tasa de producción de células (P) se redujo en un 71% (Tabla 3). L estera depende de la longitud de las células que salen del meristemo (l div) , el tiempo de estas células pasan en la zona de elongación (T el), y la tasa de expansión celular relativa (R el). No se observó efecto de l div, mientras que R EL se redujo en un 67% en las condiciones de sequía. Este efecto fue compensado por la casi triplicación de T EL, lo que resultó en la misma l mat </ Sub> como en las condiciones de control. La disminución de la tasa de producción de células, a su vez, causada por tanto una menor tasa de celdas medio de división (D) y un menor número de células en el meristemo (mer N). Duración del meristemo (L mer) se redujo en contraste con la longitud de la zona de crecimiento (L gz), que no fue afectada significativamente. En conclusión, estos resultados muestran que en este caso, el número de células, a diferencia de tamaño de la celda, tenía un papel importante en la determinación de tamaño de la hoja.

parámetros cinemáticos do re % De cambio de CD p-valor
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0.8 ± 0.0 -73 0.000
l mat (m) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (células / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (células · célula -1 · h -1) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
Tc (h) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
Div T (h) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0,010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R EL (m · m -1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
l div (m) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (h) 42 ± 2 125 ± 11 199 0.000
N EL 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -dieciséis 0,010

Tabla 3. Análisis cinemático en la división celular y la expansión celular durante el crecimiento en estado estacionario de la quinta hoja de. las plantas y las plantas bien regadas sometidas a estrés de sequía datos son medias ± error estándar (n = 5, por LL: n = 10). Se utilizó la prueba t de Student como un análisis estadístico. Parámetros: longitud de la hoja (LL), tasa de elongación de la hoja (LER), longitud de la célula madura (l tapete), la tasa de producción de células (P), las tasas de división celular (D), la duración del ciclo celular (Tc), tiempo en zona de división ( T div), longitud del meristemo (L mer), el número de células en el meristemo (mer N), la tasa de elongación celular relativa (R el), la longitud de las células que salen del meristemo (l div), el tiempo en la zona de elongación (T el), el número de células en la zona de elongación (N el), la longitud de la zona de crecimiento (L gz), el número de células en la zona de crecimiento (N gz), condiciones de buen riego (C), el estrés por sequía ( D), una D no significativa (NS).

figura 3
Figura 3:. Relación entre los parámetros cinemáticos la longitud final de la hoja (LL) depende de la elongación de la hoja Rate (LER), que a su vez depende de la producción de células (P) y la longitud de célula madura (l mat). El número de células en el meristemo (mer N) y la tasa de división celular (D) junto determinar P, con una duración del ciclo celular (T c) como la inversa de D. Tiempo en la zona de alargamiento (T el), la longitud de las células que salen del meristemo (l div), y la tasa de expansión celular relativa (R el) determinar la longitud de la célula madura (l mat). El número de células en la zona de elongación (N el)..jove.com / archivos / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además de su aplicación como un análisis detallado de crecimiento de los órganos, el análisis cinemático ofrece un mapa de crecimiento de las hojas y la localización de la zona permite el muestreo con una resolución de subzona molecular y análisis bioquímicos 4,10,11. Como ejemplo, la Figura 4A muestra malondialdehído cuantificación (MDA) a lo largo de la zona de crecimiento de la hoja de maíz en plantas sometidas a las mismas condiciones que anteriormente. MDA es un metabolito secundario formado durante la peroxidación de lípidos por ROS y refleja los niveles de daño oxidativo 12. MDA se midió en cada centímetro de la hoja, a partir de su base, lo que permitió el análisis de los cambios de concentración a lo largo del gradiente de crecimiento 11. Como el tratamiento de sequía causó 40% de acortamiento de la hoja, la longitud de las zonas de desarrollo (meritallo, zona de elongación, y la zona madura) en las plantas de control no coinciden con la longitud de las mismas zonas en las que la sequía las plantas estresadas (Figura 4B). Como se ve en la figura 4B, el meristemo en las plantas de control fue de alrededor de 1.5 cm de largo, y la zona de elongación se extendió desde 1,5 a 6,8 cm de la base de la hoja. En las plantas estresadas, el meristema se localizó entre 0 y 1,1 cm y la zona de elongación de 1,1 a 6,1 cm. Los niveles de MDA y toda la zona de crecimiento se incrementaron en las plantas afectados por la sequía en comparación con el tratamiento de control. Con la ayuda de la análisis cinemático, podemos concluir que el contenido de MDA se aumentó particularmente en la zona maduro para ambos tratamientos de control y la sequía. Sin conocer los tamaños de las zonas de desarrollo, llegamos a la conclusión de que, en condiciones de sequía, los aumenta el contenido de MDA en una etapa de desarrollo temprano que en las plantas de control, lo que sería incorrecto, ya que no tiene en cuenta el desplazamiento de las zonas debido a tque el acortamiento de la hoja. Por lo tanto, la realización de análisis cinemático antes de las mediciones bioquímicas de crucial importancia para la interpretación de los datos correctamente.

Figura 4
Figura 4: Ejemplo de mediciones bioquímicas de alta resolución y toma de muestras para el análisis centrado malonaldehıdo (MDA) concentraciones (A) medidos a lo largo de la zona de crecimiento de las hojas de maíz (dividido en diez segmentos) de plantas cultivadas condición en bien regado y plantas sometidas a la sequía. tratamiento 10. Los datos son medias ± error estándar (n = 5). ANOVA de dos vías se utilizó como un análisis estadístico, y los valores de p se presentan al lado del panel gráfico (factores: la sequía (d) y el segmento (s)); FW: peso fresco. (B) La visualización de las diferentes zonas de crecimiento en el control y las plantas a la sequía estresado. zona División (D), zona de elongación (E), yzona maduro (M). Las células se magnifican 125 veces. (C) el perfil de la célula de longitud de control y las plantas a la sequía tratada. Los datos son medias ± error estándar (n = 5). (D) Las diferencias en el muestreo centrado tanto en las plantas a la sequía tratado de control y. Los cuadros azules indican la posición de muestreo para comparar la misma etapa de desarrollo en ambos tratamientos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además de ofrecer la posibilidad de comparar las mismas zonas de desarrollo en los estudios de alta resolución, el análisis cinemático también podría utilizarse como base para los análisis más centrado, en los que se toman sólo las muestras de zonas específicas que contienen células en la misma etapa de desarrollo. Se compararon los perfiles de longitud celular, proporcionados por la suavización de las medidas de la longitud de células microscópicas, en los diez primeros centimeters de la base de la hoja de control y las plantas a la sequía estresado. La Figura 4C muestra que, utilizando el perfil de longitud de la célula, se podría determinar la longitud de las zonas de desarrollo y también podría seguir la dinámica tasa de crecimiento tanto en las plantas a la sequía subrayado control y. Esto permitió el muestreo específico de la proliferación de células en el meristemo (antes de la fuerte aumento), la expansión de las células en la zona de alargamiento (en el medio de la fuerte aumento) y las células maduras jóvenes en la zona madura (comienzo de la meseta). Nuestros resultados muestran que, debido al acortamiento de la hoja en respuesta a la sequía, estas zonas no se correspondían en el control y en las plantas estresadas. Con el fin de probar la proliferación, en expansión, y las células maduras jóvenes en las plantas de control, necesitábamos el primero, quinto y noveno centímetro de la base de la hoja, respectivamente. Sin embargo, en las plantas estresadas, estos segmentos corresponden a la primera, cuarta y octava centímetro, respectivamente. Este tipo de más centradomuestreo ha demostrado ser útil en el caso de los estudios más laboriosos, caros, o requieren mucho tiempo, tales como ARN de la secuencia, la proteómica, la metabolómica, etc.

Archivo 1:. R-guión de procedimiento de suavización polinómica favor, haga clic derecho para descargar el archivo.

Archivo complementaria 2:. Los cálculos de los parámetros cinemáticos favor, haga clic derecho para descargar el archivo.

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Discussion

Un análisis cinemático completo en las hojas de maíz permite la determinación de la base celular de crecimiento de la hoja y permite el diseño de estrategias de muestreo eficientes. Aunque el protocolo es relativamente sencillo, algunos se recomienda precaución en los siguientes pasos críticos: (1) Es importante separar las hojas más jóvenes cerrados (paso 2.3) sin dañar el meristemo, ya determinación de la longitud de meristemas (paso 3) requiere la completa meristemo de estar presente. Un poco de práctica de antemano podría ser necesaria. (2) determinación de la longitud meristemático se basa en la interpretación de figuras mitóticas. Por lo tanto, le recomendamos que, dentro de un experimento, la misma persona lleva a cabo estas medidas para reducir la varianza debida al ejecutor. (3) A pesar de que sólo diez centímetros se utiliza para la medición de la longitud real de la celda, es importante incluir once centímetros cuando se cosecha el segmento de mediciones de la longitud de la célula (paso 2.5), debido a que el borde del segmento no hacet siempre sumergir completamente en etanol y / o ácido láctico. Por lo tanto, este centímetro adicional garantiza la limpieza de los primeros diez centímetros de la zona de crecimiento. (4) Al final, es útil para inspeccionar el resultado de todos los parámetros cinemáticos que confirmar que son correctos. En la Tabla 3, por ejemplo, la tasa de producción de células (P) de las plantas a la sequía subrayado se redujo en un 71%, o, en otras palabras, P sequía es 0,29 del control P. Dado que la producción de células depende de la tasa de división celular media (D; -63%) y el número de células en meristemas (N mer; -20%; Figura 3), lo siguiente puede ser utilizado para validar la salida: P (0.29) ≈ mer N (0,8) x D (0,37). El mismo se puede aplicar para la LER = P x I estera.

Dependiendo de las instalaciones disponibles, el protocolo puede ser modificado en algunos pasos. (1) A más de unaVANZADO alternativa para las mediciones de la longitud de la hoja manuales diarias (paso 1.3) se basa en la velocidad de desplazamiento lineal (LVDT) transductores 13. Su ventaja es que permite mediciones a una resolución de tiempo mucho mayor, que van desde minutos a segundos. (2) Es fundamental incluir la zona de crecimiento completo durante el muestreo. Sin embargo, las condiciones ambientales, el genotipo, la especie y la etapa de desarrollo examinadas podrían alterar la longitud de la zona de crecimiento. Por lo tanto, es útil para hacer una primera estimación de la longitud de la zona de crecimiento en respuesta a su tratamiento experimento. Este protocolo se basa en la línea consanguínea B73 cultivadas a 25 ° C / 18 ° C (día / noche) a 300-400 μEm -2 s -1 (radiación fotosintéticamente activa - PAR). (3) Con el fin de visualizar las figuras mitóticas (paso 3.8) sin utilizar la fluorescencia, una mancha Fuelgen se puede aplicar 14. (4) El suavizado de los datos también se puede realizar en MS Excel en lugar de R mediante el uso de un qua de cinco puntoscuadrático ajustada con la función "ESTIMACION.LINEAL" 15.

Una limitación importante de esta técnica es que toda la zona de crecimiento necesita ser cosechada durante el crecimiento de estado estacionario. Con el fin de asegurar el crecimiento de estado estacionario, las plantas idealmente deben ser cultivadas bajo condiciones de crecimiento controladas, porque las fluctuaciones en la intensidad de la luz, la temperatura o la humedad afectan a la velocidad de alargamiento de la hoja 16. Por esta razón, el análisis cinemático es menos adecuado para las plantas cultivadas en condiciones de campo. Otro inconveniente es que las hojas tienen que ser convertido, lo que hace imposible para examinar las hojas que todavía están encerrados en las hojas más viejas. Finalmente, el protocolo es adecuado para especies monocotiledóneas con grandes zonas de crecimiento que comprenden al menos unos pocos centímetros. Un análisis cinemático en monocotiledóneas más pequeñas (por ejemplo, Poa, arroz), sin embargo, es factible, pero necesita algunas modificaciones en la preparación de la muestra 17,18.

Otro uso frecuentemented enfoque para analizar los fenotipos de crecimiento diferenciales es el análisis clásico de crecimiento. Este análisis cuantifica tasas de crecimiento relativo toda la planta y determina la asignación subyacente de carbono derivado fotosintética en una nueva área fotosintética y en otras partes de la planta 19. El análisis cinemático, sin embargo, permite una comprensión más detallada de los procesos celulares subyacentes que están acopladas a los fenotipos de crecimiento basado en la cuantificación de la división celular y la expansión. Por otra parte, la posibilidad de determinar la longitud de cada zona de crecimiento permite la correlación de las mediciones moleculares a lo largo del eje de la hoja a la etapa de desarrollo específico que se ve afectado por el tratamiento en estudio. Esto es fundamental para la interpretación de los datos. Cuando limitada en el tiempo o el presupuesto o cuando interesado en etapas específicas de desarrollo, el resultado de este análisis permite la toma de muestras centrado, reduciendo el número de muestras necesarias para el análisis. En conclusión, el análisis cinemático permites la determinación de parámetros celulares que subyacen a las respuestas al estrés y la variación genética en el crecimiento de las hojas y puede vincularlos con los procesos de regulación aguas arriba (Tabla 2).

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una beca de doctorado de la Universidad de Amberes a VA; una beca de doctorado de la Fundación de Ciencias de Flandes (FWO, 11ZI916N) de KS; subvenciones para proyectos de la FWO (G0D0514N); una beca de investigación actividad de investigación concertada (GOA), "Un enfoque de Biología de Sistemas de la hoja de la morfogénesis" del Consejo de Investigación de la Universidad de Amberes; y la atracción Interuniversitario polacos (IUAP VII / 29, MARS), "El maíz y Arabidopsis raíces y brotes de crecimiento" de la Oficina Federal de Bélgica Ciencia Política (BELSPO) para GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani y Hamada Abdelgawad contribuyeron al video .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

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Análisis cinemático de la división celular y la expansión: La cuantificación de la base celular del crecimiento y el desarrollo en las zonas de muestreo<em&gt; Zea mays</em&gt; Las hojas
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