Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kinematisk Analyse af celledeling og Expansion: Kvantificering af Cellular Grundlag for vækst og Sampling Developmental zoner i Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Vækst analyse afhænger af en række værktøjer, der er almindeligt anvendt af plante forskere til at beskrive genotype bestemmes vækst forskelle og / eller fænotypiske reaktioner på miljømæssige faktorer. De omfatter størrelse og vægt målinger af hele planten eller et organ og beregninger af vækstraterne at udforske de underliggende mekanismer for vækst. Organvækst bestemmes ved celledeling og ekspansion på celleniveau. Derfor herunder kvantificering af disse to processer i vækst analyser er nøglen til at forstå forskelle i hel-orgel vækst 1. Det er derfor afgørende at have en passende metode til at bestemme cellulære vækst parametre, som er forholdsvis let at bruge ikke-specialiserede laboratorier.

Er allerede etableret Kinematisk analyse som en tilgang giver en stærk ramme for udviklingen af orgel vækstmodeller 2. Teknikken er blevet optimeret til lineære systemer,såsom Arabidopsis thaliana rødder og enkimbladede blade, men også for ikke-lineære systemer, såsom tokimbladede blade 3. I dag er denne metode stigende grad til at undersøge, hvorledes genetiske, hormonale, udviklingsmæssige og miljømæssige faktorer har indflydelse celledeling og ekspansion i forskellige organer (tabel 1). Desuden, det giver også en ramme til at linke cellulære processer til deres underliggende biokemiske, molekylære og fysiologiske regler (tabel 2), selv om begrænsninger kan pålægges af orgel størrelse og rumlige organisation for teknikker, der kræver større mængder af plantemateriale (f.eks metabolit målinger, proteomics, etc.).

Enkimbladede blade, såsom majs (Zea mays) blad, betyder lineære systemer, hvor celler flytter fra bunden af bladet mod spidsen, sekventielt går gennem meristem og forlængelse zone at nå det modnezone. Dette gør det til et ideelt modelsystem for kvantitative undersøgelser af de rumlige mønstre af vækst 4. Desuden majs blade har store vækst zoner (meristem og forlængelse zone spænder flere centimeter 5) og giver mulighed for studier på andre organisatoriske niveauer. Dette giver mulighed for undersøgelse af de (formodede) regulatoriske mekanismer, der styrer celledeling og ekspansion, kvantificeres ved kinematiske analyse gennem en række molekylære teknikker, fysiologiske målinger, og cellebiologi tilgange (tabel 2).

Her giver vi en protokol til at udføre en kinematisk analyse i enkimbladede blade. Først, vi forklarer, hvordan du udføre en grundig analyse af både celledeling og celle forlængelse som en funktion af position langs bladet aksen og hvordan man beregner kinematiske parametre. For det andet viser vi også, hvordan dette kan anvendes som grundlag for prøvetagning design. Her diskuterer vi to tilfælde: høj opløsning sampling etd fokuseret prøveudtagning, muliggør forbedret data fortolkning og besparelsen af ​​tid / penge, hhv.

Tabel 1. Oversigt over kinematiske analyser metoder til kvantificering af celledeling og ekspansion i forskellige organer.

organ reference
enkimbladede blade 16, 20, 21, 22
rodspidserne 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
tokimbladede blade 21, 30, 31
skyde apikal meristem 32

Tabel 1. Oversigt over kinematiske analyser metoder til kvantificering af celledeling og ekspansion i forskellige organer.

Tabel 2. Forbindelse mellem cellulære processer kvantificeret ved den kinematiske analyse til deres regulering på det molekylære niveau. Henvisninger til forskellige undersøgelser forbinder kvantificering af cellulære processer til resultaterne fra biokemiske og molekylære assays i forskellige arter og organer. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyd (MDA), cyclin-afhængige kinaser (CDK). Klik her for at se en større version af denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Følgende protokol til kinematisk analyse gælder kun for blade under steady state vækst. Dette indebærer en stabil blad forlængelse sats og rumlige mønstre af celle længde og ekspansion i et blad i en periode på flere dage 6.

1. Plant Growth og Målinger af Leaf Forlængelse Rate (LER)

  1. Vælg et blad i steady-state vækst og et udviklingsstadium interesse.
    BEMÆRK: Der er en forskel mellem steady state vækst og gentagne vækst, hvilket indebærer tilsvarende rumlige mønstre på hinanden følgende blade på den samme akse. I de tidlige stadier af sætteplante vækst, successive blade typisk vokser mere og hurtigere på grund af den voksende størrelse af væksten zone 7. Selvom et par højere blad positioner kan have en lignende vækstmønster 8, er det en forbigående fase, der kan blive påvirket af behandlinger, der undersøges. Det er derfor vigtigt at sammenligne linjer og tr eatments strengt på samme blad position, selv om det kan være at udvikle på et andet tidspunkt. Selv med en konstant forlængelse hastighed, vækstraten profil er ikke nødvendigvis det samme på forskellige udviklingsstadier. Det er derfor vigtigt at analysere blade på samme udviklingstrin 8, typisk defineret ved antallet af dage efter fremkomsten.
  2. For at udføre en fuld kinematisk analyse af vækst blad i enkimbladede, vokse mindst 15 anlæg til hver behandling og genotype under kontrollerede forhold i en vækst rum.
  3. På tidspunktet for blade af interesse vises (fremkomst fra krans af omgivende blade), begynder at måle længden af bladet dagligt med en lineal, indtil bladet er fuldt ekspanderet (Figur 1i). Blad længde indebærer længden fra jordoverfladen til spidsen af ​​bladet. Vær omhyggelig med ikke at bryde eller beskadige bladet, da det kan ændre dens vækst.

re en "src =" / files / ftp_upload / 54.887 / 54887fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skematisk oversigt over en kinematisk analyse af majs blade Bladet af interesse måles med en lineal for tre på hinanden følgende dage for at beregne Leaf Forlængelse Rate (LER). Derefter blad høstes og en tre-centimeter segment anvendes til bestemmelse af meristem størrelse. Dette gøres ved at måle længden fra bunden op til den mest distale mitotiske tal efter DAPI-farvning. (A) Eksempler på proliferative mitotiske tal og (B) formative mitotiske tal. De første elleve centimeter fra bladfoden på den anden side af midten vene anvendes til at skære ti på en centimeter segmenter for målinger celle længde. Disse målinger giver grundlaget for at skabe cellen længde profil, som tjener til at bestemme den modne celle længde (l mat) og længden af celler forlader meristem (l div). Det l måtten anvendes til at beregne cellen produktionshastighed (P), medens l div og L mer anvendes til at beregne antallet af celler i meristemet (N mer). Til gengæld er P og N mer anvendes til at beregne den gennemsnitlige celledeling sats (D), som er den inverse af cellecyklus varighed (Te). Pile af samme farve indikerer parametre, der bruges til at beregne parameter følgende på disse pile. Scale barer = 40 um. Roman tal bruges til at henvise til specifikke eksperimentelle procedurer beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Høst

  1. På udviklingsstadium interesse (f.eks, den tredje dag efter fremkomsten), vælge mindst fem repræsentative plants fra det parti, som at foretage den kinematiske analyse. Fortsæt måling resten af ​​planterne som beskrevet i trin 1.3 for at bestemme den endelige blad længde.
  2. Skær over jorden del af planten. For at holde meristematiske del intakt, skåret så tæt som muligt på rødderne (figur 1ii).
  3. Startende fra de yderste blade, fjerne alle blade op til bladet af interesse ved forsigtigt udrulning dem én efter én. Fjern om nødvendigt et par ekstra millimeter fra bunden for at frigøre bladene. Fjern også apex og små blade omgivet af bladet af interesse (Figur 1iii).
  4. Skær en 3 cm segment, startende fra bunden på den ene side af midten vene, og opbevar det i et 1,5 ml reagensglas fyldt med 3: 1 (v: v) absolut ethanol: eddikesyreopløsning (ADVARSEL: bære handsker) på 4 ° C i 24 timer op til flere måneder (fig 1iv). Dette segment vil senere blive anvendt til at bestemme længden af ​​meristemet.
  5. Fraanden side af venen, skære en 11 cm forneden (figur 1 vol), og som anbringes i et 15 ml rør fyldt med absolut ethanol ved 4 ° C i mindst 6 timer for at fjerne pigmenter (figur 1 vi).
    BEMÆRK: Senere bruger kun de første 10 cm til at bestemme cellens længde profil (se Diskussion).
  6. Forny absolut ethanol til en anden runde af rengøring ved 4 ° C i mindst 24 timer (figur i 1.).
  7. Endelig erstatte absolut ethanol med ren mælkesyre (ADVARSEL: brug handsker) til rengøring og opbevaring ved 4 ° C i 24 timer eller indtil videre brug (figur i 1.).

3. Meristem Længde Målinger

  1. Der fremstilles en skylning buffer indeholdende 50 mM natriumchlorid (NaCl), 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA; ADVARSEL: brug handsker) og 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-saltsyre (Tris-HCI, pH 7).
  2. Tag 3 cm segment fra afsnit 2.4 og såak det i bufferen i 20 min (fig 1vii).
  3. Mens vi venter, bruge skylning buffer til at forberede en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning opløsning af 1 mg / ml, holde det på is og i mørke.
  4. Farv kernerne ved at placere meristem segment for 2-5 min i DAPI-farvningsopløsning. Arbejde på is og i mørke (fig 1vii).
  5. Check for fluorescens signal ved hurtigt at montere segment på et mikroskopi glas og dække den med et dækglas. De epidermale celler bør vise fluorescens, mens de underliggende cellelag bør ikke.
  6. Hvis farvningen ikke er tilstrækkelig, sætte segmentet tilbage i DAPI-farvningsopløsning i nogle ekstra minutter.
  7. For at stoppe farvningen, montere segmenterne i en dråbe skylning buffer på en mikroskopi slide og dække med et dækglas.
  8. Brug et mikroskop udstyret med UV-fluorescens ved en 20X forstørrelse, hvilket muliggør visualisering af omkring 1.000 epidermisal-celler på en gang. Rul i hele segmentet og se efter proliferative mitotiske tal (metafase, anafase, telofase og cytokinese), men undgå formativ celledeling af udviklingslandene stomata (figur 1viii) 9. Definere, hvor den mest distale mitotiske tal er placeret.
  9. Bestemme længden af ​​meristemet ved at måle afstanden mellem bunden af ​​bladet og den mest distale epidermal mitotiske tal. Bruge et billede-analyse software (f.eks ImageJ) for at måle den fulde længde af billedrammen.
    1. Tæl antallet af frames, der dækker den fulde meristem længde (fra bladet basen til den mest distale mitotisk figur) og ganger dette tal med længden af en ramme for at opnå den fulde meristem længde (figur 1ix).

4. Cell Længde Profile

  1. Tag det segment, der er gemt i mælkesyre (trin 2.5) og læg den forsigtigt på bænken. Skær segmenter witha skalpel i 10 segmenter af en cm hver (figur 1x).
  2. Monter de successive blad segmenter på en mikroskopi dias i en lille dråbe af mælkesyre. Sørg for at konsekvent står enten adaxial eller abaxial opad. I princippet er der ingen præference for en bestemt side.
  3. Brug et mikroskop udstyret med differential interferens kontrast (DIC) optik til at analysere segmenter, begyndende fra bladfoden. Mål med en billedopløsning analyse software længden af ​​mindst 20 gentagne epidermisceller i filer direkte op til stomatale filer i rækkefølge at konsekvent vælge den samme celletype.
    1. Gør dette på jævnt fordelte positioner langs hver af de segmenter (4 positioner pr segment tilstrækkelige), og sørg for at nedskrive den tilsvarende position for hver måling i hele bladet (Figur 1xi).
  4. Bestem den gennemsnitlige celle længde ved hver mm langs bladet akse ved hjælp af en lokal polynomium udjævning pROCEDURE, implementeret i en R-script (Figur 1xii; Supplerende File 1).
    BEMÆRK: R-script giver en række data med stigende udjævning. Mængden af ​​udjævning kræves, er noget vilkårlige og ideelt burde bare fjerne den lokale støj, men ikke påvirke den samlede kurve. Sørg for at bruge den samme mængde udjævning for alle prøver inden et eksperiment.
  5. Gennemsnit celle længden på hver position mellem planter og beregne standardfejlen for at skabe en celle længde profil langs bladet akse.

5. Beregninger af Kinematisk Parametre (Se Supplerende fil 2)

  1. Beregn LER ved at tage ændringen i blad længde mellem to på hinanden følgende tidspunkter (f.eks 24 HR, som i trin 1.3) og dividere det med tidsintervallet.
  2. Beregne længden af væksten zone (L gz) svarer til positionen distalt fra basen, hvor cellerne når 95% af deres modne cell længde på smoothened celle længdeprofil.
    1. Tag for hver position på smoothened celle længde profil 95% af gennemsnittet af alle celle længder efter denne stilling (figur 2).
    2. Sammenlign glittesinden celle længder (trin 4.4) med den beregnede 95% celle længde på hver position. Begyndende fra bunden af bladet, vækstzonen slutter ved den position, hvor den faktiske celle længde er lig 95% af følgende celle længder (Figur 2; se supplerende data 2).

Figur 2
Figur 2:. Bestemmelse enden af vækstzonen Meristem: Ved positionen angivet med en rød stjerne, den faktiske cellestørrelse er mindre end 95% (rød stiplet linie) fra den gennemsnitlige cellestørrelse på alle celler efter denne position (rødt faststof linje). Den ende af væksten zone (L gz, angivet med ablue stjerne) er placeret, hvor 95% (punkteret blå linje) fra den gennemsnitlige cellestørrelse på alle celler efter denne position (helt blå linie) er lig den faktiske cellestørrelse. Division zone (D), forlængelse zone (E), og moden zone (M). Stiplede pile angiver konvergensen mellem den lokale størrelse og 95% af den gennemsnitlige størrelse over den distale del af bladet, når de flytter fra de basale positioner til spidsen af bladet. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Beregne længden af forlængelsen zone (L el) som forskellen mellem længden af væksten zone (L gz) og meristem størrelse (L mer; bestemt i trin 3).
  2. Beregn den modne celle længde (l mat) som den gennemsnitlige celle længde i den modne zone.
  3. Divider LER ved L måtten til opnåelse afcelle produktionshastighed (P).
  4. Beregne antallet af celler i forlængelsen zone (N el) som forskellen mellem N gz og N mer. Antallet af celler i meristemet (N mer) er lig den kumulative antal celler placeret i pauserne svarer til meristem. Antallet af celler i vækst zone (N gz) er lig den kumulative antal celler placeret i pauserne svarende til væksten zone.
  5. Beregn den gennemsnitlige celledeling sats (D) som P / N mer. Varigheden cellecyklus (T c) er lig ln (2) / D.
  6. Beregn den tid i forlængelse zone (T el) ved at dividere N el af P. Tiden i divisionen zone lig log 2 (N mer) * T c. Længden af celler forlader meristem (l div)lig cellen længden fra smoothened celle længdeprofil i slutningen af ​​meristemet.
  7. Beregn den gennemsnitlige celle ekspansion sats (R el) ved hjælp af følgende formel: ln (l mat) -ln (l div)] / T el.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi en sammenligning mellem godt vandes planter (kontrol, 54% jord vandindhold (SWC)) og planter udsat for tørke stress betingelser (tørke, 34% SWC) i form af deres vækst blad. Alle planter blev dyrket i et vækstkammer under kontrollerede forhold (16 timer dag / 8 timers nat, 25 ° C / 18 ° C dag / nat, 300-400 μEm -2 sek -1 fotosyntetisk aktiv stråling (PAR). De tørke blev etableret ved at tilbageholde vand, indtil den korrekte SWC blev nået, og derefter yderligere vedligeholdes. i en indledende undersøgelse blev det defineret, at det femte blad er den første til at dukke op og udvikle sig under denne stress tilstand. det blev derfor valgt som blad interesse. den endelige Leaf Længde (LL) af tørke-understregede planter var 40% lavere end den af de godt vandes planter, hvilket skyldes en lavere LER (tabel 3). for at forstå den cellulære grundlag af leaf vækstrespons, udførte vi en kinematisk analyse. Samlet, blad forlængelse er en funktion af cellens produktion i meristem og moden cellestørrelse bestemmes i forlængelsen zone (figur 3). Derfor skal afkortning af bladet skyldes virkninger på et eller begge af disse parametre. Vores resultater viser, at mens den modne celle længde (l mat) ikke blev påvirket blev cellen produktionshastighed (P) reduceres med 71% (tabel 3). L mat afhænger af længden af cellerne der forlader meristem (l div) den tid disse celler tilbringer i forlængelsen zone (T el), og den relative celle udvidelseshastighed (R el). Ingen effekt blev observeret for l div, mens R el blev reduceret med 67% i de tørke. Denne effekt blev opvejet af næsten tredobling af T el, hvilket resulterede i den samme l mat </ Sub> som i kontrol betingelser. Faldet i celle produktionshastighed var til gengæld skyldes både en lavere gennemsnitlig celledeling sats (D) og et mindre antal celler i meristemet (N mer). Længde meristemet (L mer) blev reduceret i modsætning til længden af væksten zone (L gz), som ikke blev påvirket væsentligt. Som konklusion viser disse resultater, at i dette tilfælde, celleantal modsætning cellestørrelse, havde en større rolle i fastlæggelsen blad størrelse.

kinematiske parametre C D % Ændring CD p-værdi
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 -73 0.000
l måtte (um) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (celler / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (celler · celle -1 · h-1) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
Te (hr) 26 ± 3 71 ± 7 173 0.000
T div (hr) 249 ± 27 656 ± 71 164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0.010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R el (um · um h-1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
l div (um) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (hr) 42 ± 2 125 ± 11 199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0.010

Tabel 3. Kinematisk analyse på celledeling og celleekspansion under steady-state vækst af den femte blad af. godt vandes planter og planter udsat for tørkestress data er gennemsnit ± SE (n = 5, for LL: n = 10). T-test blev anvendt som en statistisk analyse. Parametre: blad længde (LL), blad forlængelse rentesikringsaftaler (LER), moden celle længde (l mat), celle produktion rentesikringsaftaler (P), celledeling rentesikringsaftaler (D), cellecyklus varighed (T c), tid i division zone ( T div), længden af meristemet (L mer), antal celler i meristemet (N mer), relativ celleforlængelse rate (R el), cellernes længde forlader meristemet (l div), tid i forlængelsen zone (T el), antallet af celler i forlængelsen zone (N el), længden af væksten zone (L gz), antallet af celler i vækst zone (N gz), well-vandes betingelser (C), vandstress ( D), en d ikke signifikant (NS).

Figur 3
Figur 3:. Relationer mellem de kinematiske parametre Den endelige blad længde (LL) afhænger af Leaf Elongation Rate (LER), som igen afhænger af cellens produktion (P) og moden celle længde (l mat). Antallet af celler i meristemet (N mer) og celledeling sats (D) sammen bestemme P, med en cellecyklus varighed (Te) som det modsatte af D. Tid i forlængelsen zone (T el), længde af celler forlader meristem (l div), og den relative celle ekspansion sats (R el) bestemme den modne celle længde (l mat). Antallet af celler i forlængelsen zone (N el)..jove.com / filer / ftp_upload / 54.887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Ud over sin ansøgning som en detaljeret analyse af orgel vækst, kinematisk analyse giver et kort over zone lokalisering vækst blad og tillader sampling med en subzonal opløsning for molekylær og biokemisk analyser 4,10,11. Som et eksempel, figur 4A viser malondialdehyd (MDA) kvantificering langs væksten zone af bladet majs i planter udsat for de samme betingelser som ovenfor. MDA er en sekundær metabolit dannes under lipidperoxidation af ROS og afspejler niveauerne af oxidativ skade 12. MDA blev målt i hver centimeter af bladet, startende fra dens bund, hvilket tillod analyse af koncentrationsændringer langs væksten gradient 11. Som tørke behandling forårsagede 40% blad afkortning, længden af ​​de udviklingsmæssige zoner (meristængel, forlængelse zone, og moden zone) i kontrol planter svarer ikke længden af de samme zoner i tørken stressede planter (figur 4B). Som det ses i figur 4B, den meristem i kontrolplanterne var omkring 1,5 cm lang, og forlængelsen zone spændte fra 1,5 til 6,8 cm fra bladfoden. I de stressede planter blev meristem lokaliseret fra 0 til 1,1 cm og forlængelsen zonen fra 1,1 til 6,1 cm. MDA-niveauer og hele vækst zone blev forøget i tørke-stressede planter sammenlignet med kontrolgruppen behandling. Ved hjælp af den kinematiske analyse, kunne vi konkludere, at MDA indhold især blev forøget i det modne zone for både kontrol- og tørke behandlinger. Uden at kende størrelsen af ​​de udviklingsmæssige områder, ville vi konkludere, at under tørkestress, de MDA indhold stigninger i en tidligere udviklingstrin end i kontrolgruppen planter, hvilket ville være forkert, da den ikke tager højde for flytning af zonerne skyldige til than blad afkortning. Derfor udfører kinematisk analyse forud for de biokemiske målinger var af afgørende betydning for at fortolke data korrekt.

Figur 4
Figur 4: Eksempel på høj opløsning biokemiske målinger og prøveudtagning for fokuseret analyse (A) malonaldehyd (MDA) koncentrationer målt langs vækst majs blad zone (opdelt i ti segmenter) af planter dyrket i godt vandes tilstand og planter udsat for tørke. behandling 10. Data er gennemsnit ± SE (n = 5). To-ANOVA blev anvendt som en statistisk analyse, og p-værdier er vist ved siden af ​​grafen panel (faktorer: tørke (d) og segment (s)); FW: frisk vægt. (B) Visualisering af de forskellige vækstzoner i kontrol og tørke-understregede planter. Division zone (D), forlængelse zone (E), ogmodne zone (M). Celler er forstørret 125 gange. (C) Cell-længdeprofil af kontrol og tørke-behandlede planter. Data er gennemsnit ± SE (n = 5). (D) Forskelle i fokuseret prøvetagning i både kontrol og tørke-behandlede planter. De blå felter angiver prøveudtagning stand til at sammenligne den samme udviklingsstadiet i begge behandlinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Ud over at give mulighed for at sammenligne de samme udviklingsmæssige zoner i høj opløsning undersøgelser, kunne den kinematiske analyse også bruges som grundlag for mere målrettede analyser, hvor kun prøver af specifikke zoner, der indeholder celler på samme udviklingstrin er taget. Vi sammenlignede celle længde profiler, der leveres af den udjævning af målinger de mikroskopiske celle længde, i de første ti centimeters fra bladfoden af kontrol og tørke-understregede planter. Figur 4C viser, at ved hjælp af cellen længdeprofil, kunne vi bestemme længden af de udviklingsmæssige zoner og kunne også følge vækstraten dynamik i både kontrol- og tørke-understregede planter. Dette gav specifik prøvetagning af prolifererende celler i meristem (før den stejle stigning), ekspanderende celler i forlængelse zone (i midten af ​​den stejle stigning) og unge modne celler i den modne zone (begyndelsen af ​​plateauet). Vores resultater viser, at på grund bladet afkortning i afhængighed af tørke, har disse zoner ikke svarer i kontrollen og i de stressede planter. For at prøve prolifererende, udvide og unge modne celler i kontrol planter, vi havde brug for det første, femte og niende centimeter fra bladet basen, henholdsvis. Men i de stressede planter, disse segmenter svarer til den første, fjerde og ottende centimeter hhv. Denne form for mere fokuseretprøveudtagning har vist sig at være nyttig i tilfælde af mere arbejdskrævende, kostbare, eller tidskrævende undersøgelser, såsom RNA-sekventering, proteomics, metabolomics, etc.

Supplerende Fil 1:. R-script til polynomium udjævning procedure venligst højreklik for at downloade denne fil.

Supplerende Fil 2:. Beregninger af kinematiske parametre venligst højreklik for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fuld kinematisk analyse på majsblade muliggør bestemmelse af den cellulære grundlag af vækst blad og muliggør design af effektive stikprøvestrategier. Selvom protokollen er forholdsvis ligetil, er en vis forsigtighed anbefales i følgende kritiske trin: (1) Det er vigtigt at frigøre de yngre, lukkede blade (trin 2.3) uden at beskadige meristem, da meristem længde bestemmelse (trin 3), kræver det komplette meristem at være til stede. forhånd kan være behov nogle praksis. (2) bestemmelse meristematisk længde er baseret på fortolkningen af ​​mitotiske figurer. Derfor anbefaler vi, at der inden et eksperiment, den samme person udfører disse målinger til at reducere variansen på grund af eksekutor. (3) Selv om kun ti centimeter bruges til de faktiske målinger celle længde, er det vigtigt at medtage elleve centimeter, når høst segmentet for målinger celle længde (trin 2.5), fordi kanten af ​​segmentet gør ikket altid fuldt nedsænkes i ethanol og / eller mælkesyre. Derfor er denne ekstra centimeter sikrer clearing af de første ti centimeter af væksten zone. (4) I sidste ende, er det nyttigt at inspicere resultatet af alle kinematiske parametre for at bekræfte, at de er korrekte. I tabel 3 for eksempel cellen produktionshastigheden (P) af tørke-understregede planter var nedsat med 71%, eller med andre ord, P tørke er 0,29 P kontrol. Da produktionen cellen afhænger af gennemsnitlig celledeling sats (D -63%) og antallet af celler i meristem (N mer, -20%, figur 3), kan følgende bruges til at validere output: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). Det samme kan anvendes til LER = P x I mat.

Afhængigt af de tilgængelige faciliteter, kan protokollen ændres i nogle trin. (1) En mere enVANCEREDE alternativ til daglige målinger de manuelle blad længde (trin 1.3) er baseret på lineær hastighed forskydningstransducere (LVDT'er) 13. Dens fordel er, at den muliggør målinger på et langt højere tidsopløsning, der spænder fra minutter til sekunder. (2) Det er afgørende at medtage komplette vækst zone under prøvetagningen. Imidlertid miljøforhold, genotype, arter, og udviklingsstadium undersøgt kan ændre længden af ​​væksten zone. Derfor er det nyttigt at gøre et første skøn over længden af ​​væksten zone som svar på dit eksperiment behandling. Denne protokol er baseret på den indavlede linie B73 dyrket ved 25 ° C / 18 ° C (dag / nat) ved 300-400 μEm -2 s -1 (Fotosyntetisk Active Radiation - PAR). (3) For at visualisere mitotiske figurer (trin 3.8) uden anvendelse af fluorescens, kan en Fuelgen plet anvendes 14. (4) Udjævningen af ​​dataene kan også udføres i MS Excel stedet for R ved at anvende en fem-punkts quadratic montering med "LINREGR" funktion 15.

En vigtig begrænsning ved denne teknik er, at hele vækst zone skal høstes under steady-state vækst. For at sikre ligevægt vækst, skal planter ideelt dyrkes under kontrollerede vækstbetingelser, fordi fluktuationer i lysintensitet, temperatur eller fugtighed påvirke bladet forlængelse sats 16. Af denne grund er den kinematiske analyse er mindre egnet til planter dyrket under markbetingelser. En anden ulempe er, at bladene skal frem, hvilket gør det umuligt at undersøge blade, der er stadig omsluttet af ældre blade. Endelig er den protokol egnet til enkimbladede arter med store vækstzoner der omfatter mindst nogle få centimeter. En kinematisk analyse på mindre enkimbladede (f.eks Poa, ris), dog er muligt, men har brug for nogle ændringer i prøven forberedelse 17,18.

En anden bruger ofted tilgang til analyse vækstdifferentiale fænotyper er den klassiske vækstanalyse. Denne analyse kvantificerer hele planten relative vækstrater og bestemmer den underliggende fordeling af fotosyntetiske afledt kulstof i et nyt fotosyntetiske område og ind i andre dele af planten 19. Den kinematiske analyse imidlertid mulighed for en mere detaljeret forståelse af de underliggende cellulære processer, der er koblet til vækst fænotyper baseret på kvantificering celledeling og ekspansion. Desuden er muligheden for at bestemme længden af ​​hvert vækst zone muliggør korrelationen af ​​molekylære målinger langs bladet aksen til den specifikke udviklingsstadiet, der påvirkes af behandlingen under undersøgelse. Dette er kritisk for fortolkningen af ​​data. Når tidsbegrænset eller budget, eller når interesseret i bestemte udviklingsstadier, resultatet af denne analyse giver mulighed for målrettet prøveudtagning, at reducere antallet af prøver, der kræves til analyse. Det kan konkluderes, kinematisk analyse aktiveres bestemmelse af cellulære parametre ligger til grund for stressreaktioner og genetisk variation i vækst blad og kan linke dem til opstrøms regulatoriske processer (tabel 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en ph.d.-stipendium fra universitetet i Antwerpen til VA; et ph.d.-stipendium fra den flamske Science Foundation (FWO, 11ZI916N) til KS; projektbevillinger fra FWO (G0D0514N); en samordnet forskningsaktivitet (GOA) forskningsbevilling, "En Systembiologi tilgang af Leaf Morfogenese" fra forskningsråd fra University of Antwerpen; og universitetscenter Type polakker (IUAP VII / 29, MARS), "Majs og Arabidopsis Root og skyde Vækst" fra den belgiske Science Policy Office (BELSPO) til GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani og Hamada Abdelgawad alle bidraget til video .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Quantitative analyses of cell division in plants. Plant Mol. Biol. 60, 963-979 (2006).
  2. Silk, W. K., Erickson, R. O. Kinematics of Plant-Growth. J. Theor. Biol. 76, 481-501 (1979).
  3. Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Chapter 14 (2010).
  4. Avramova, V., Sprangers, K., Beemster, G. T. S. The Maize Leaf: Another Perspective on Growth Regulation. Trends Plant Sci. 20, 787-797 (2015).
  5. Rymen, B., et al. Cold nights impair leaf growth and cell cycle progression in maize through transcriptional changes of cell cycle genes. Plant Physiol. 143, 1429-1438 (2007).
  6. Muller, B., Reymond, M., Tardieu, F. The elongation rate at the base of a maize leaf shows an invariant pattern during both the steady-state elongation and the establishment of the elongation zone. J. Exp. Bot. 52, 1259-1268 (2001).
  7. Beemster, G. T. S., Masle, J., Williamson, R. E., Farquhar, G. D. Effects of soil resistance to root penetration on leaf expansion in wheat (Triticum aestivum L): Kinematic analysis of leaf elongation. J. Exp. Bot. 47, 1663-1678 (1996).
  8. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Spatial and Temporal Aspects of Leaf Growth-Inhibition. Planta. 191, 433-439 (1993).
  9. Sylvester, A. W., Smith, L. G. Cell Biology of Maize Leaf Development. Handbook of maize: It's Biology. Bennetzen, J. L., Hake, S. C. , Springer. NY. (2009).
  10. Nelissen, H., et al. A Local Maximum in Gibberellin Levels Regulates Maize Leaf Growth by Spatial Control of Cell Division. Curr. Biol. 22, 1183-1187 (2012).
  11. Avramova, V., et al. Drought Induces Distinct Growth Response, Protection, and Recovery Mechanisms in the Maize Leaf Growth Zone. Plant Physiol. 169, 1382-1396 (2015).
  12. Picaud, J. C., et al. Total malondialdehyde (MDA) concentrations as a marker of lipid peroxidation in all-in-one parenteral nutrition admixtures (APA) used in newborn infants. Pediatr. Res. 53, 406 (2003).
  13. Basu, P., Pal, A., Lynch, J. P., Brown, K. M. A novel image-analysis technique for kinematic study of growth and curvature. Plant Physiol. 145, 305-316 (2007).
  14. Vander Weele, C. M., et al. A new algorithm for computational image analysis of deformable motion at high spatial and temporal resolution applied to root growth. Roughly uniform elongation in the meristem and also, after an abrupt acceleration, in the elongation zone. Plant Physiol. 132, 1138-1148 (2003).
  15. Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Plant Organogenesis. DeSmet, I. , Chapter 17 (2013).
  16. Ben-Haj-Salah, H., Tardieu, F. Temperature Affects Expansion Rate of Maize Leaves without Change in Spatial-Distribution of Cell Length - Analysis of the Coordination between Cell-Division and Cell Expansion. Plant Physiol. 109, 861-870 (1995).
  17. Fiorani, F., Beemster, G. T. S., Bultynck, L., Lambers, H. Can meristematic activity determine variation in leaf size and elongation rate among four Poa species? A kinematic study. Plant Physiol. 124, 845-855 (2000).
  18. Pettko-Szandtner, A., et al. Core cell cycle regulatory genes in rice and their expression profiles across the growth zone of the leaf. J. Plant Res. 128, 953-974 (2015).
  19. Poorter, H., Remkes, C. Leaf-Area Ratio and Net Assimilation Rate of 24 Wild-Species Differing in Relative Growth-Rate. Oecologia. 83, 553-559 (1990).
  20. Macadam, J. W., Volenec, J. J., Nelson, C. J. Effects of Nitrogen on Mesophyll Cell-Division and Epidermal-Cell Elongation in Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 89, 549-556 (1989).
  21. Tardieu, F., Granier, C. Quantitative analysis of cell division in leaves: methods, developmental patterns and effects of environmental conditions. Plant Mol. Biol. 43, 555-567 (2000).
  22. Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Possible Role of Some Mineral Elements in Growth-Inhibition. Planta. 196, 699-705 (1995).
  23. Erickson, R. O., Sax, K. B. Rates of Cell-Division and Cell Elongation in the Growth of the Primary Root of Zea-Mays. P. Am. Philos. Soc. 100, 499-514 (1956).
  24. Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
  25. Goodwin, R. H., Stepka, W. Growth and differentiation in the root tip of Phleum pratense. Am. J. Bot. 32, 36-46 (1945).
  26. Hejnowicz, Z. Growth and Cell Division in the Apical Meristem of Wheat Roots. Physiologia Plantarum. 12, 124-138 (1959).
  27. Gandar, P. W. Growth in Root Apices .1. The Kinematic Description of Growth. Bot. Gaz. 144, 1-10 (1983).
  28. Baskin, T. I., Cork, A., Williamson, R. E., Gorst, J. R. Stunted-Plant-1, a Gene Required for Expansion in Rapidly Elongating but Not in Dividing Cells and Mediating Root-Growth Responses to Applied Cytokinin. Plant Physiol. 107, 233-243 (1995).
  29. Sacks, M. M., Silk, W. K., Burman, P. Effect of water stress on cortical cell division rates within the apical meristem of primary roots of maize. Plant Physiol. 114, 519-527 (1997).
  30. Granier, C., Tardieu, F. Spatial and temporal analyses of expansion and cell cycle in sunflower leaves - A common pattern of development for all zones of a leaf and different leaves of a plant. Plant Physiol. 116, 991-1001 (1998).
  31. De Veylder, L., et al. Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell. 13, 1653-1667 (2001).
  32. Kwiatkowska, D. Surface growth at the reproductive shoot apex of Arabidopsis thaliana pin-formed 1 and wild type. J. Exp. Bot. 55, 1021-1032 (2004).
  33. Kutschmar, A., et al. PSK-alpha promotes root growth in Arabidopsis. New Phytol. 181, 820-831 (2009).
  34. Vanneste, S., et al. Plant CYCA2s are G2/M regulators that are transcriptionally repressed during differentiation. Embo J. 30, 3430-3441 (2011).
  35. Eloy, N. B., et al. Functional Analysis of the anaphase-Promoting Complex Subunit 10. Plant J. 68, 553-563 (2011).
  36. Eloy, N. B., et al. SAMBA, a plant-specific anaphase-promoting complex/cyclosome regulator is involved in early development and A-type cyclin stabilization. P. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 13853-13858 (2012).
  37. Dhondt, S., et al. SHORT-ROOT and SCARECROW Regulate Leaf Growth in Arabidopsis by Stimulating S-Phase Progression of the Cell Cycle. Plant Physiol. 154, 1183-1195 (2010).
  38. Baute, J., et al. Correlation analysis of the transcriptome of growing leaves with mature leaf parameters in a maize RIL population. Genome Biol. 16, (2015).
  39. Andriankaja, M., et al. Exit from Proliferation during Leaf Development in Arabidopsis thaliana: A Not-So-Gradual Process. Dev. Cell. 22, 64-78 (2012).
  40. Beemster, G. T. S., et al. Genome-wide analysis of gene expression profiles associated with cell cycle transitions in growing organs of Arabidopsis. Plant Physiol. 138, 734-743 (2005).
  41. Spollen, W. G., et al. Spatial distribution of transcript changes in the maize primary root elongation zone at low water potential. Bmc Plant Biol. 8, (2008).
  42. Candaele, J., et al. Differential Methylation during Maize Leaf Growth Targets Developmentally Regulated Genes. Plant Physiol. 164, 1350-1364 (2014).
  43. West, G., Inze, D., Beemster, G. T. S. Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant Physiol. 135, 1050-1058 (2004).
  44. Zhang, Z., Voothuluru, P., Yamaguchi, M., Sharp, R. E., Peck, S. C. Developmental distribution of the plasma membrane-enriched proteome in the maize primary root growth zone. Front. Plant Sci. 4, (2013).
  45. Bonhomme, L., Valot, B., Tardieu, F., Zivy, M. Phosphoproteome Dynamics Upon Changes in Plant Water Status Reveal Early Events Associated With Rapid Growth Adjustment in Maize Leaves. Mol. Cell Proteomics. 11, 957-972 (2012).
  46. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Assimilate Partitioning in the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades at High and Low Irradiance. Plant Physiol. 90, 1201-1206 (1989).
  47. Schnyder, H., Nelson, C. J., Spollen, W. G. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .2. Dry-Matter Partitioning and Carbohydrate-Metabolism in the Elongation Zone and Adjacent Expanded Tissue. Plant Physiol. 86, 1077-1083 (1988).
  48. Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Carbohydrate Fluxes within the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 85, 548-553 (1987).
  49. Vassey, T. L., Shnyder, H. S., Spollen, W. G., Nelson, C. J. Cellular Characterisation and Fructan Profiles in Expanding Tall Fescue. Curr. T. Pl. B. 4, 227-229 (1985).
  50. Allard, G., Nelson, C. J. Photosynthate Partitioning in Basal Zones of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 95, 663-668 (1991).
  51. Spollen, W. G., Nelson, C. J. Response of Fructan to Water-Deficit in Growing Leaves of Tall Fescue. Plant Physiol. 106, 329-336 (1994).
  52. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .1. Relationship to Genetically Altered Leaf Elongation Rates. Plant Physiol. 74, 590-594 (1984).
  53. Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .2. Relationship to Leaf Elongation Rates Modified by Nitrogen-Fertilization. Plant Physiol. 74, 595-600 (1984).
  54. Silk, W. K., Walker, R. C., Labavitch, J. Uronide Deposition Rates in the Primary Root of Zea-Mays. Plant Physiol. 74, 721-726 (1984).
  55. Granier, C., Inze, D., Tardieu, F. Spatial distribution of cell division rate can be deduced from that of p34(cdc2) kinase activity in maize leaves grown at contrasting temperatures and soil water conditions. Plant Physiol. 124, 1393-1402 (2000).
  56. Voothuluru, P., Sharp, R. E. Apoplastic hydrogen peroxide in the growth zone of the maize primary root under water stress.1. Increased levels are specific to the apical region of growth maintenance. J. Exp. Bot. 64, 1223-1233 (2012).
  57. Wu, Y. J., Jeong, B. R., Fry, S. C., Boyer, J. S. Change in XET activities, cell wall extensibility and hypocotyl elongation of soybean seedlings at low water potential. Planta. 220, 593-601 (2005).
  58. Macadam, J. W., Nelson, C. J., Sharp, R. E. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .1. Spatial-Distribution of Ionically Bound Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 872-878 (1992).
  59. Macadam, J. W., Sharp, R. E., Nelson, C. J. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .2. Spatial-Distribution of Apoplastic Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 879-885 (1992).
  60. Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inze, D. Variation in growth rate between Arabidopsis ecotypes is correlated with cell division and A-type cyclin-dependent kinase activity. Plant Physiol. 129, 854-864 (2002).
  61. Kavanova, M., Lattanzi, F. A., Schnyder, H. Nitrogen deficiency inhibits leaf blade growth in Lolium perenne by increasing cell cycle duration and decreasing mitotic and post-mitotic growth rates. Plant Cell Environ. 31, 727-737 (2008).
  62. Macadam, J. W., Nelson, C. J. Secondary cell wall deposition causes radial growth of fibre cells in the maturation zone of elongating tall fescue leaf blades. Ann. Bot-London. 89, 89-96 (2002).
  63. Schnyder, H., Nelson, C. J. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .1. Spatial-Distribution of Growth, Deposition of Water, and Assimilate Import in the Elongation Zone. Plant Physiol. 86, 1070-1076 (1988).
  64. Gastal, F., Nelson, C. J. Nitrogen Use within the Growing Leaf Blade of Tall Fescue. Plant Physiol. 105, 191-197 (1994).
  65. Vanvolkenburgh, E., Boyer, J. S. Inhibitory Effects of Water Deficit on Maize Leaf Elongation. Plant Physiol. 77, 190-194 (1985).
  66. Silk, W. K., Hsiao, T. C., Diedenhofen, U., Matson, C. Spatial Distributions of Potassium, Solutes, and Their Deposition Rates in the Growth Zone of the Primary Corn Root. Plant Physiol. 82, 853-858 (1986).
  67. Meiri, A., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Deposition of Inorganic Nutrient Elements in Developing Leaves of Zea-Mays L. Plant Physiol. 99, 972-978 (1992).
  68. Neves-Piestun, B. G., Bernstein, N. Salinity-induced inhibition of leaf elongation in maize is not mediated by changes in cell wall acidification capacity. Plant Physiol. 125, 1419-1428 (2001).
  69. Bouchabke, O., Tardieu, F., Simonneau, T. Leaf growth and turgor in growing cells of maize (Zea mays L.) respond to evaporative demand under moderate irrigation but not in water-saturated soil. Plant Cell Environ. 29, 1138-1148 (2006).
  70. Westgate, M. E., Boyer, J. S. Transpiration-Induced and Growth-Induced Water Potentials in Maize. Plant Physiol. 74, 882-889 (1984).
  71. Horiguchi, G., Gonzalez, N., Beemster, G. T. S., Inze, D., Tsukaya, H. Impact of segmental chromosomal duplications on leaf size in the grandifolia-D mutants of Arabidopsis thaliana. Plant J. 60, 122-133 (2009).
  72. Fleury, D., et al. The Arabidopsis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth. Plant Cell. 19, 417-432 (2007).
  73. Vlieghe, K., et al. The DP-E2F-like gene DEL1 controls the endocycle in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 15, 59-63 (2005).
  74. Boudolf, V., et al. The plant-specific cyclin-dependent kinase CDKB1;1 and transcription factor E2Fa-DPa control the balance of mitotically dividing and endoreduplicating cells in Arabidopsis. Plant Cell. 16, 2683-2692 (2004).
  75. Baskin, T. I., Beemster, G. T. S., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).

Tags

Plantebiologi Kinematisk analyse blad vækst enkimbladede blade majs celledeling celle ekspansion meristem molekylær prøveudtagning
Kinematisk Analyse af celledeling og Expansion: Kvantificering af Cellular Grundlag for vækst og Sampling Developmental zoner i<em&gt; Zea mays</em&gt; Blade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprangers, K., Avramova, V.,… More

Sprangers, K., Avramova, V., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves. J. Vis. Exp. (118), e54887, doi:10.3791/54887 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter