Använda Linear Agarose kanaler att studera<em> Drosophila</em> Larvernas Genomsökning Behavior
Summary
Drosophila larv är en kraftfull modell för att studera neurala kontroll av beteende. Denna publikation beskriver användningen av linjära agaros kanaler för att framkalla fördröjd anfall av linjär genomsökning och metoder för att kvantifiera de dynamiken i larv strukturer under repetitiva krypande beteende.
Abstract
Drosophila larver genomsökning framstår som en kraftfull modell för att studera neurala kontrollen av sensomotorisk beteende. Men är larver krypande beteende på plana öppna ytor komplex, inklusive: paus, vrida och slingrande. Komplexiteten i repertoaren rörligheten hindrar detaljerad analys av de händelser som inträffar under en enda genomsökning steg cykel. För att övervinna detta hinder, var linjära agaros kanaler gjort att begränsa larv beteende raka, ihållande, rytmiska krypande. I princip eftersom agaros kanaler och Drosophila larvkroppen är både optiskt klar, förflyttning av larv strukturer märkta av genetiskt kodade fluorescerande prober kan övervakas i intakt, fritt rörliga larver. I det förflutna, har larver placerades i linjära kanaler och krypa på nivån för hela organismen, segment, och muskel analyserades 1. I framtiden kan larver kryper i kanaler användas för kalcium avbildning för att övervaka neuronal aktivitet. Dessutom kan dessa metoder användas med larver av någon genotyp och varje forskare utformad kanal. Protokollet presenteras nedan är alltså allmänt tillämpas för studier med Drosophila larven som en modell för att förstå motorstyrning.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att studera Drosophila larver genomsökning i detalj. Experiment på förflyttning har spelat en viktig roll i att utveckla och testa teorier om motorisk kontroll 2. Traditionellt förflyttning har studerats i vattenlevande djur (t.ex. blodigel, nejonöga, grodyngel) 3. Repetitiva karaktär av förflyttning i dessa djur har gjort för att studera rhythmogenesis, för analys av de biofysiska händelser driver förflyttning och för att övervaka de neurala bränning mönster som följer förflyttning.
Användningen av Drosophila larver för studier av rörelsepresenterar en unik kombination av fördelar jämfört med andra modellsystem: facile genetik, väldefinierad utveckling, en kropp som är optiskt klar på grundnivå och avancerad instars, och en pågående transmissionselektronmikroskop rekonstruktion av hela nervsystemet 4-6. Emellertid Drosophila larv locorörelse på plana öppna ytor är något komplex inklusive pauser, vänder, och slingrande kryper 7. Denna publikation presenterar en metod för att använda linjära agaros kanaler för att styra Drosophila larvrörelsebeteende så att larverna utföra ihållande, rak, rytmisk krypande beteende.
Studera Drosophila larver beteende i agaros kanaler, i stället för beteende på plana öppna ytor, har flera fördelar. För det första medger det forskare att specifikt välja krypa beteende från de många rörelser som är en del av den larver beteenderepertoar. För det andra, genom att justera bredden på den kanal som funktion larvkroppsstorlek, krypande hastighet kan justeras. För det tredje, kanaler möjliggör larven ses från rygg, ventrala, eller laterala sidan beroende på hur larven är laddad och orienterad inom kanalen. Denna mångsidighet i larv orientering tillåter någon struktur av intresse att vara ständigt synliga under genomsökning. Fjärde,kanaler är mottagliga för användning med en bred variation av mikroskop och mål. Till exempel kan linjära kanaler användas för lågupplöst avbildning på ljusfält stereoscopes och / eller för hög upplösning avbildning på spinnskiv konfokala mikroskop 1. Femte, kan denna metod användas i kombination med optogenetic / thermogenetic neuronala manipulationer i någon genetisk bakgrund. Slutligen, eftersom både larvkroppen (vid första och andra instars) och agaros kanaler är optiskt klara, kanaler kan användas när man studerar de dynamiska rörelser eller förändringar i fluorescensintensitet av larv strukturer märkta av genetiskt kodade fluorescerande prober.
Den beskrivna metoden är lämplig för detaljerade kinematiska studier av första och andra stadiet Drosophila larver beteende. Denna publikation analyserar de dynamiska förändringar i fluorescensintensitet av CNS under framåt larver krypande att demonstrera användningen av kanaler och som en föregångare till Neuronal kalcium avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En mikroflödessystem enhet byggdes för att göra linjära agaros kanaler som kan rymma Drosophila larver (Figur 1). När Drosophila larver placeras i dessa linjära agaros kanaler deras beteenderepertoar är begränsad till krypa, vilket gör det möjligt för detaljerad observation av dynamiken i larv strukturer över genomsökningen cykeln.
En framgångsrik inspelning sker när en larv utföra en serie av rytmiska steg (Figur 3). Om det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
