Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren<em> Drosophila</em> Larvale Crawling Behavior
Summary
De Drosophila larven is een krachtig modelsysteem om neuronale controle van gedrag te bestuderen. Deze publicatie beschrijft het gebruik van lineaire agarose kanalen om aanhoudende aanvallen van lineaire kruipen en methoden te lokken om de dynamiek van larvale structuren te kwantificeren tijdens repetitieve kruipen gedrag.
Abstract
Drosophila larven kruipen is in opkomst als een krachtig model voor neurale controle van sensomotorische gedrag te bestuderen. Echter, larven kruipen gedrag op een vlakke ondergrond geopend is complex, met inbegrip van: pauzeren, draaien en kronkelen. Deze complexiteit in het repertoire van beweging belemmert gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens een enkele kruipen stap cyclus. Om dit obstakel te overwinnen, werden lineaire agarose kanalen gemaakt dat larvale gedrag recht, duurzame, ritmische kruipen beperken. In principe, omdat agarose kanalen en de Drosophila larven lichaam zowel optisch helder, de beweging van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes kan worden gevolgd in intacte, vrij bewegende larven. In het verleden werden larven in lineaire kanalen geplaatst en kruipen op het niveau van hele organisme, segment, en spier werden geanalyseerd 1. In de toekomst kan larven kruipen kanalen worden gebruikt calcium imaging neuro bewakennal activiteit. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden gebruikt met larven van elke genotype en eventuele-onderzoeker ontworpen kanaal. Waardoor het protocol hieronder is breed toepasbaar voor studies op de Drosophila larven als model motorbesturing begrijpen.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is om Drosophila larven kruipen in detail te bestuderen. Experimenten op motoriek hebben een belangrijke rol in het ontwikkelen en testen van theorieën over motorische controle 2 gespeeld. Traditioneel motoriek is onderzocht bij waterdieren (bv, bloedzuiger, lamprei, kikkervisje) 3. Het repetitieve karakter van de motoriek bij deze dieren is toegelaten voor de studie van rhythmogenesis, voor de analyse van de biofysische evenementen rijden motoriek, en voor het bewaken van de neurale afvuren patronen die de motoriek te begeleiden.
Het gebruik van Drosophila larven voor studies van beweging een unieke combinatie van voordelen boven andere modelsystemen: facile genetica, goed gekarakteriseerde ontwikkeling, een orgaan dat optisch helder in eerste en tweede stadia, en een voortdurende transmissie elektronen microscopische reconstructie van de gehele zenuwstelsel 4-6. Echter, Drosophila larvale locomotion op een vlakke ondergrond geopend is enigszins complex met inbegrip van pauzes, draaien, en meanderende kruipt 7. Deze publicatie geeft een methode om lineaire agarose kanalen gebruiken om Drosophila larvale locomotorisch gedrag te begeleiden, zodat de larven voeren volgehouden, recht, ritmische kruipen gedrag.
Bestuderen Drosophila larven gedrag agarose kanalen, in plaats van gedrag vlakke oppervlakken geopend, heeft verschillende voordelen. Ten eerste kunnen onderzoekers eerst selecteren crawlgedrag uit de vele bewegingen die deel uitmaken van de larvale gedragsrepertoire. Ten tweede, door het aanpassen van de breedte van het kanaal ten opzichte van de larvale lichaamsgrootte, stapvoets kan worden aangepast. Derde kanalen zorgen voor de larve wordt vanuit dorsale, ventrale of laterale afhankelijk van de larve is geplaatst en georiënteerd binnen het kanaal. Deze veelzijdigheid in larvale oriëntatie zorgt voor een structuur van belang om voortdurend zichtbaar tijdens het kruipen zijn. Vierde,kanalen zijn vatbaar voor gebruik met een groot aantal microscopen en doelstellingen. Zo kan bijvoorbeeld de lineaire kanalen worden gebruikt voor lage-resolutie beeldvorming over bright-field stereoscopen en / of voor hoge-resolutie beeldvorming over spinning-disk confocale microscopen 1. Ten vijfde kan deze werkwijze worden gebruikt in combinatie met optogenetic / thermogenetische neuronale handelingen met genetische achtergrond. Tenslotte, omdat zowel de larvale lichaam (in eerste en tweede stadia) en agarose kanalen optisch helder, kanalen kunnen worden gebruikt bij het bestuderen van de dynamische bewegingen, of veranderingen in fluorescentie-intensiteit van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes.
De beschreven methode is geschikt voor gedetailleerde kinematische studie van de eerste en tweede instar Drosophila larvale gedrag. Deze publicatie analyseert de dynamische veranderingen in fluorescentie-intensiteit van het centrale zenuwstelsel tijdens de voorwaartse larven kruipen op het gebruik van kanalen te tonen en als een voorloper van NeuRonal calcium imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een microfluïdische apparaat werd gebouwd om lineaire agarose kanalen die geschikt zijn Drosophila larven (figuur 1) te maken. Bij Drosophila larven in deze lineaire agarose kanalen geplaatst zijn gedragsrepertoire beperkt tot kruipen, waardoor gedetailleerde observatie van de dynamiek van larvale structuren via kruipen cyclus.
Een opname op wanneer een larve voeren een reeks ritmische stappen (Figuur 3). Als dit niet gebeurt, controleer h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
