Denne studien beskriver en avbildning-baserte mikro nøytralisering assay for å analysere de antigene forholdet mellom virus. Protokollen benytter en planskanner og har fire trinn, inkludert titrering, titrering kvantifisering, nøytralisering, og nøytralisering kvantifisering. Analysen fungerer godt med strøm sirkulerer influensa A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus.
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Micro-nøytralisering (MN) analyser er anvendt i virologi for kvantifisering av nøytraliserende antistoffer og antivirale aktiviteter. Som et alternativ til hemagglutineringshemming (HI) analyser, MN analyser kan overvinne ikke-antigene effekter påvirket av affinitet endringer i reseptor-binding i influensavirus, som kan komplisere tolkningen av HI resulterer 1,2,3. Inntil nylig var de fleste MN analyser basert på cytopatiske effekter (CPE) eller enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) 4,5. MN analyser basert på fokus og plakk reduksjon ble utviklet i 1990 6,7,8. Plakkreduksjons analyser stole på telle synlige plaketter å kvantifisere smittsomhet. Men visuelle tellinger dekker bare store plakk som kan løses av menneskelige øyne, selv om de fleste av plakk er små og usynlige for mange av dagens sirkulerende virus. Dette ufullstendig dekning kan forårsake betydelig variasjon mellom sensorer og mellom eksperimenter, som fører til jegncomparable resultater. Det er også umulig å bruke metoden når noen virus viser avbrytende infeksjon av enkeltceller eller svært små plakk.
Den dårlige telling oppløsning kan forbedres ved innføring av en avbildning-basert protokoll. Med fremskritt innen teknologi, optisk mikroskopi og høy gjennomstrømming godt plate leserne kan gi nøyaktige metoder for å telle de infiserte celler 9. I henhold til en trans-belyste mikroskop, kan infiserte celler som er merket med visse markører bli visualisert ved deres absorpsjon eller fluorescens kontrast i sub-cellulær oppløsning. En prøve kan deretter bli analysert på en dataskjerm.
Uheldigvis, på grunn av begrensning i synsfeltet, er mer enn hundre lagte bilder som kreves for å dekke en enkelt brønn. Analysere en plate med 96 brønner vil kreve bildebehandling og behandling av om lag ti tusen bilder. En slik arbeidskrevende prosess er tidkrevende og kostbart, og oppløsningen fikk er i general unødvendig for rutinemessig karakterisering av virusinfeksjoner. Laboratorier med et begrenset budsjett kan finne at tilnærmingen bygget rundt en planskanner gir en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming alternativ.
I denne artikkelen beskriver vi en forbedret plakkreduksjon MN analyse som er egnet for den antigene karakterisering av et stort antall virus og for kvantitativ måling av antiviral aktivitet og nøytralisering antistoffer. Analysen har flere fordeler: For det første er det en bildebasert assay som er i stand til å måle virus infeksjoner på cellenivå, uavhengig av plakk størrelse. Å telle det totale infiserte cellepopulasjon (ICP) inne i en brønn i stor grad øker deteksjonsfølsomheten, noe som gjør det mulig å karakterisere de virus med lav smittsomhet. For det andre, blir en mer nøyaktig kvantitativ titrering tilsettes før nøytralisering for å bestemme mengden av inngangsvirus. Den kvantitative innspill virus reduserer varia betydeligsjon mellom ulike eksperimenter og gjør resultatene mer sammenlignbare mellom laboratorier. For det tredje kan nøytralisering titere bestemmes direkte ved å analysere bildene, noe som gjør kvantifisering rask og brukervennlig. Til slutt tilveiebringer protokollen en kostnadseffektiv og high-throughput alternativ med den nødvendige oppløsning og nøyaktighet. Den kvantifisering er basert på en planskanner og gratis databehandling programvare. Hele oppsettet har en liten plass og er deployerbare i de fleste laboratorier.
Protokollen presentert i denne artikkelen består av fire store skritt, inkludert virus titrering, titrering kvantifisering, virus nøytralisering, og nøytralisering kvantifisering. Virus-titrering er et preparat eksperiment som bestemmer mengden av inngangsvirus som skal brukes i nøytralisering. I løpet av en titrering, er en rekke virus konsentrasjoner anvendes på cellemonolagene i en 96-brønns plate. De infiserte celler blir deretter kvantifisert i § 2. viral Dilusjon som produserer 20% -85% ICP er i sin tur brukt som inngangs virus til tilsvarende nøytralisering i § 3. titer av nøytraliser protokollen er kvantifisert ved hjelp av seksjon 4. Eksperimenter som fulgte de ovennevnte protokollene er presentert i de representative resultater. Analysen har blitt testet grundig i løpet av de siste to årene med de fleste av dagens sirkulerende influensavirus, som A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus. Resultatene av influensavirus karakterisering ble inkludert i rapportene for WHO konsultasjonsmøte som ga anbefalinger om influensavaksiner til bruk på den sørlige halvkule i 2016 og den nordlige halvkule i 2016-2017.
I denne studien beskrev vi en bildebasert MN analyse for å kvantifisere den sanne antigene relasjoner mellom virus. Sammenlignet med andre plaque-reduksjonsanalyser, understreker fremgangsmåten måling av ICP av en hel brønn, sikre fullstendig dekning av infeksiøs befolkningen. Uavhengighet av plakkdannelse også utvider anvendelsen av analysen for virus som kan danne i hovedsak usynlig små plakker eller som bare kan administrere en enkelt celle infeksjon. Derfor er analysen i stand til å undersøke flere virus og effektene av et bredere spekter av antistoffer enn HI, og det bidrar til mer omfattende reflektere de antigene likheter og forskjeller mellom virus 12. For eksempel når oseltamivirkarboksylat er inkludert, MN analysen er mindre påvirket av NA-avhengig binding, noe som reflekterer de antigene forskjeller mer nøyaktig. Under utviklingen av analysen, ble store anstrengelser gjort for å forbedre forsøket konsistens, hastighet, og deteksjonfølsomhet, blant annet ved å kontrollere inngangs virus gjennom kvantifisert titrering, bildebehandling i høy gjennomstrømming med en planskanner, og implementere en brukervennlig databehandling plattform. Resultatene har generelt vært i samsvar med og bekreftet de av HI. Spesielt resultatene viste også antigene forskjeller mellom antigen drift varianter av nyere type A og B vaksine virus, samt antigene endringer forårsaket av kultur valgt eller sporadiske endringer, for eksempel G155E substitusjon i HA1 av visse A (H1N1) pdm09 virus 12.
Protokollen matchet virustype eller subtype med utvelgelse av cellelinjer som ga de sterkeste infeksjon, som i stor grad forbedret bildesignalet. Eksperimentell variasjon ble glattet med utformingen av dubletter som balansert med antallet av testede antisera. Usikkerhet kan også komme fra bildekvaliteten, som hovedsakelig påvirket av bildeenhet. En anstendig fargeplanskanner kan signifikantforbedre ficantly kontrasten i bildet og redusere støy. Mengden av inngangsvirus i nøytraliseringen må være kvantitativt bestemt på forhånd fra den tilsvarende titreringen mens virus fortsatt opprettholde et tilsvarende status. Under nøytraliseringen, antiserumet respons på en infeksjon er normalisert mot forskjellen mellom referanse virus (VC) og bakgrunnsnivået (CC). Nøyaktige målinger av VC og CC er avgjørende for en nøytralisering eksperiment. Flere duplikater er anbefalt (åtte duplikater ble brukt i de representative resultater). Til slutt, forstå programvaren er avgjørende for å lykkes med et eksperiment. Programvaren er testet for rutinemessig virus karakterisering i WHO Influensasenteret, UK for mer enn to år. Detaljerte instruksjoner for å håndtere ulike situasjoner er gitt i tilleggs S1.
Dette MN analysen er egnet for applikasjoner der prøvene dekker en extremely stort synsfelt, men krever bare moderat bildeoppløsning. Den lave kostnader og enkelt oppsett gjør systemet lett tilgjengelig for de fleste virologi laboratorier. Variasjonen i målinger av samme prøve var mindre enn 3%, noe som omtrent definerer usikkerheten introdusert i løpet av 11 scanning. En slik reproduserbarhet er tilstrekkelig i mange virologiske studier og kan reduseres ytterligere ved å danne gjennomsnitt bilder fra flere avsøkninger.
Som konklusjon, denne studien viser en robust MN-analyse som kan rutinemessig brukt i antigene studier og å støtte HI data i detaljerte analyser av tiden-sirkulerende influensavirus, særlig for den halvårlige utvalg av virus for inkludering i menneskelige influensavaksiner.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
Trypsin | Sigma | T1426 | |
Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |