2D и 3D-матрицы для изучения формирования и активности линейных инвадосом
Summary
В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.
Abstract
Клеточная адгезия, миграция и инвазия участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Например, во время образования метастазов опухолевые клетки должны пересекать анатомические барьеры, чтобы вторгнуться и мигрировать через окружающую ткань, чтобы достичь кровеносных или лимфатических сосудов. Для этого требуется взаимодействие между клетками и внеклеточным матрицей (ECM). На клеточном уровне многие клетки, включая большинство раковых клеток, способны образовывать инвадусомы, которые представляют собой структуры на основе F-актина, способные разрушать ECM. Invadosomes – это протрузивные актиновые структуры, которые рекрутируют и активируют матриксные металлопротеиназы (MMP). Молекулярный состав, плотность, организация и жесткость ECM имеют решающее значение для регулирования образования и активации инвадосом. В пробирке анализ желатина является стандартным анализом, используемым для наблюдения и количественного определения активности деградации инвадосом. Однако желатин, являющийся денатурированным коллагеном I, не является физиологической матрицей element. Был разработан новый анализ с использованием коллагеновых фибрилл I типа, который показал, что эта физиологическая матрица является мощным индуктором интрадосом. Инвадосомы, которые образуются вдоль коллагеновых фибрилл, известны как линейные инвадосомы из-за их линейной организации на волокнах. Более того, молекулярный анализ линейных интрадосом показал, что рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) является рецептором, участвующим в их образовании. Эти данные наглядно демонстрируют важность использования физиологически релевантной матрицы для понимания сложных взаимодействий между клетками и ECM.
Introduction
Ремоделирование внеклеточной матрицы (ECM) происходит во время физиологических и патологических процессов, таких как ангиогенез и инвазия опухолевых клеток. В физиологических условиях многие типы клеток, в основном из гематопоэтической линии, способны деградировать элементы ECM. Например, макрофаги способны пересекать анатомические барьеры для достижения тканей, а остеокласты разрушают костный матрикс для обеспечения гомеостаза кальция. Более глобально все матрицы в организме восстанавливаются, сохраняя свои физические и химические свойства. В раковых тканях состав микроокружности опухоли изменяется. Например, при раке груди и легкого коллаген I типа сверхэкспрессируется и накапливается вокруг опухоли. Более того, это накопление связано с повышенным риском развития метастазов 1 , 2 . Раковые метастазы зависят от способности раковых клеток разрушать ECM и вторгаться в смежные ткани.
Инвазивная активность клеток объясняется специализированными актино-богатыми структурами, известными как интрадосомы. Этот термин включает подзомы и инвадоподии, которые присутствуют, соответственно, в нормальных и раковых клетках ( например, макрофагах, эндотелиальных клетках и раковых клетках, таких как клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231). In vitro , интрадосомы могут организовываться в разные формы: точки, агрегаты или розетки 3 . Классически интрадосомы состоят из ядра F-актина, содержащего несколько белков, таких как белок Taff5 и кортатин, окруженный молекулами адгезионной бляшки, такими как интегрины и винкулин 4 . Недавно было показано, что Tks5 и RhoGTPase Cdc42 могут быть использованы как минимальная молекулярная сигнатура для функциональных инвадосом 5 . Эти структуры способны разрушать ECM посредством рекрутирования и активации специфических белков металлопротеазы, таких как MT1-MMP и MMP-2 6, В предыдущем исследовании мы сообщали, что взаимодействие между фибриллами коллагена типа I и рецептором домена discoidin 1 (DDR1), специфическим рецептором фибрилл коллагена I типа, приводит к образованию нового класса инвадосом, называемых линейными инвадосомами. Линейные инвадомости образуются вдоль коллагеновых фибрилл I типа 7 . Эти структуры способны разрушать фибриллы коллагена I типа путем набора и активации MT1-MMP / MMP2. Более того, их образование зависит от Tks5 и Cdc42 5 . В пробирке мы продемонстрировали существование линейных интрадосом и вовлечение DDR1 в их формирование и активность 8, используя различные стратегии, состоящие из комбинации различных матричных элементов, в том числе: i) люминесцентные покрытые желатином покровные стекла, ii) флуоресцентный коллагеновый фибрилл I типа Покрытые покровным покрытием, и iii) вилки с коллагеном типа I. Из-за использования разных матриц мы смогли учиться и характеризоватьсяА также их деградирующей активности 7 , 8 .
Наконец, чтобы лучше понять биологию инвазивных клеток, была использована комбинация компонентов ECM в системах 2D и 3D культуры, имитирующих сложность состава микроокружения опухоли. Ниже приведены протоколы покрытия покровных стекол желатином / типом I в системах 2D и 3D культуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Классически интрадосомы изучаются in vitro без учета микроокружения и матрицы, на которой покрыты клетки. В настоящее время используются несколько типов матриц, включая желатин, фибронектин, витронектин или фибриллярный коллаген высокой плотности (HDFC) 7 , …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM поддерживалась стипендией PhD от INSERM / Région Aquitaine и в настоящее время поддерживается последипломным отделением ARC и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. EH поддерживается доктором философии от Министерства обороны и де ла Recherche. ZE поддерживается пост-докторской стипендией от Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM поддерживается Институтом рака Тиша в Медицинской школе горы Синай, а JJBC поддерживается грантом NIH / NCI K22CA196750, Фондом JJR Фонда исследований рака молочной железы TCI и Институтом рака Tisch в Медицинской школе горы Синай. Эта работа была поддержана грантом ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS поддерживается «Национальной лигой борьбы с раком». VM и FS поддерживаются при финансовой поддержке «Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016» и Национального института рака, INCA_8036 и PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
