2D og 3D matricer til at studere lineær invadosomdannelse og aktivitet
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder en 2D-blandet matrix, der består af gelatine og kollagen I, og et 3D-collagen-I-stik for at studere lineære invadosomer. Disse protokoller tillader undersøgelsen af lineær invadosomdannelse, matrixnedbrydningsaktivitet og invasionskapaciteterne af primære celler og cancercellelinier.
Abstract
Celleadhæsion, migration og invasion er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. For eksempel skal tumorceller i løbet af metastaseformationen krydse anatomiske barrierer for at invadere og migrere gennem det omgivende væv for at nå blod eller lymfekar. Dette kræver interaktionen mellem celler og den ekstracellulære matrix (ECM). På cellulært niveau er mange celler, herunder størstedelen af kræftceller, i stand til at danne invadosomer, som er F-actinbaserede strukturer, der er i stand til at nedbryde ECM. Invadosomer er fremspringende actinstrukturer, som rekrutterer og aktiverer matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Den molekylære sammensætning, densitet, organisation og stivhed af ECM er afgørende for regulering af invadosomdannelse og aktivering. In vitro er et gelatinestudie standardanalysen anvendt til at observere og kvantificere invadosomedbrydningsaktivitet. Imidlertid er gelatine, som er denatureret kollagen I, ikke en fysiologisk matrix element. Et nyt assay under anvendelse af type I-kollagenfibriller blev udviklet og anvendt til at demonstrere, at denne fysiologiske matrix er en potent inducer af invadosomer. Invadosomer, der danner langs kollagenfibrillerne, er kendt som lineære invadosomer på grund af deres lineære organisation på fibrene. Desuden viste molekylær analyse af lineære invadosomer, at discoidin-domænereceptoren 1 (DDR1) er receptoren involveret i deres dannelse. Disse data viser tydeligt betydningen af at anvende en fysiologisk relevant matrix for at forstå de komplekse interaktioner mellem celler og ECM.
Introduction
Ekstracellulær matrix (ECM) remodeling forekommer under fysiologiske og patologiske processer, såsom angiogenese og tumorcelleinvasion. I fysiologiske forhold er mange celletyper, hovedsagelig fra hæmatopoietisk stamme, i stand til at nedbryde ECM-elementer. For eksempel er makrofager i stand til at krydse anatomiske barrierer for at nå væv, og osteoklaster nedbryder knoglematrix for at sikre calciumhomeostase. Mere globalt fornyer alle matricer i kroppen at opretholde deres fysiske og kemiske egenskaber. I kræftvæv ændres tumor mikromiljøsammensætningen. For eksempel i bryst- og lungekræft er type I-kollagen overudtrykt og akkumuleres omkring tumoren. Desuden er denne ophobning forbundet med en øget risiko for udvikling af metastase 1 , 2 . Cancer metastase er afhængig af kræftcellernes evne til at nedbryde ECM og invadere tilstødende væv.
DetInvasiv aktivitet af celler tilskrives specialiserede aktinrige strukturer kendt som invadosomer. Dette udtryk omfatter podosomer og invadopodier, som er til stede i henholdsvis normale og cancerceller ( fx makrofager, endotelceller og kræftceller, såsom MDA-MB-231 brystcancercellelinien). In vitro kan invadosomer organisere i forskellige former: prikker, aggregater eller rosetter 3 . Klassisk er invadosomer sammensat af en F-actin-kerne indeholdende flere proteiner, såsom stilladsproteinet Tks5 og cortactin, omgivet af adhæsionsplakmolekyler, såsom integriner og vinculin 4 . For nylig blev det vist, at Tks5 og RhoGTPase Cdc42 kan anvendes som en minimumsmolekylær signatur for funktionelle invadosomer 5 . Disse strukturer er i stand til at nedbryde ECM'en via rekruttering og aktivering af specifikke metalloprotease proteiner, såsom MT1-MMP og MMP-2 6. I en tidligere undersøgelse rapporterede vi, at interaktionen mellem type I-kollagenfibriller og discoidin-domænereceptoren 1 (DDR1), en specifik receptor af type I-kollagenfibriller, fører til dannelsen af en ny klasse invadosomer, navngivet lineære invadosomer. Lineære invadosomer dannes langs type I collagenfibriller 7 . Disse strukturer er i stand til at nedbryde type I-kollagenfibriller via rekruttering og aktivering af MT1-MMP / MMP2. Desuden er deres dannelse afhængig af Tks5 og Cdc42 5 . In vitro demonstrerede vi eksistensen af lineære invadosomer og inddragelsen af DDR1 i deres dannelse og aktivitet 8 ved anvendelse af forskellige strategier bestående af en kombination af forskellige matrikselementer, herunder: i) fluorescerende gelatinecoated coverlips, ii) fluorescerende type I collagenfibril -coated coverlips, og iii) 3D type I collagen stik. På grund af brugen af forskellige matricer kunne vi studere og karakterereIze lineær invadosomdannelse og deres nedbrydningsaktivitet 7 , 8 .
Endelig blev der anvendt en kombination af ECM-komponenter i både 2D- og 3D-kultursystemer for bedre at forstå biologien af invasive celler, hvilket efterligner kompleksiteten af tumormikro-miljø-sammensætningen. Nedenfor er protokoller for belægningsdæksler med gelatine / type I-kollagen i 2D- og 3D-kultursystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klassisk undersøges invadosomer in vitro uden hensyntagen til mikromiljøet og den matrix, som cellerne er pletteret på. Flere typer matricer anvendes i øjeblikket, herunder gelatine, fibronektin, vitronectin eller højdensitetsfibrillar collagen (HDFC) 7 , 11 ; Imidlertid er disse ofte ikke repræsentative for mikromiljøet, hvor cellerne ligger og ikke er fysiologisk relevante. Her anvendes en ny type matrix, der består af en forbindelse mellem ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM blev støttet af et ph.d.-stipendium fra INSERM / Région Aquitaine og støttes nu af et postdoktoralt ARC-fællesskab og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. EH støttes af en ph.d. fra Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE støttes af et postdoktoralt fællesskab fra Agence National de la Recherche (ANR). CM understøttes af Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine, og JJBC støttes af NIH / NCI grant K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund og Tisch Cancer Institute ved Mount Sinai School of Medicine. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS understøttes af "Ligue nationale contre le cancer". VM og FS understøttes af finansiering fra "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" og Institut National du Cancer, INCA_8036 og PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
