Protocol
1. הכנת חומרים והתרבות בינונית
- עבור לנתיחה ו דיסוציאציה של SCz, לעטוף את מטריקס המוח, סכין גילוח פיפיות, מלקחיים עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן לעקר אותם על ידי מעוקר.
- כן 50 מיליליטר של חיץ קר PBS לשטוף את מוח העכבר כולו.
- הגדרת מיקרוסקופ לנתיחה ולהכין את כלי הניתוח הנדרש דיסקציה של (מספריים autoclaved מלקחיים) המוח ואת הבידוד של (מזרק 1 מ"ל, 30 מחט G, מטריקס המוח, מלקחיים בסדר) SCz.
- הכנת N2 בינוני:
- הכן F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + סודיום ביקרבונט) בינוני עם 2% B27, 1% תוספי N2, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.
הערה: מדיום הגידול מורכב גורמים בינוניים וצמיחת N2 (20 ng / mL גורם גדילה באפידרמיס המטוהר (EGF) ו -20 ng / mL גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF2)).
- הכן F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + סודיום ביקרבונט) בינוני עם 2% B27, 1% תוספי N2, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.
- הכן חיץ העיכול (40 יחידה / מ"ל פפאין, 2.4 יחידת / dispas מ"להדואר השני, ו -2% פניצילין, סטרפטומיצין ב PBS) לעיכול רקמה.
- הכנת צלחת ציפוי Coverslip:
- הכן-פולי-L ornithine (אש"ף; 0.01%) ו laminin (10 מיקרוגרם / מ"ל מומס O DH 2). כדי 6 צלחות גם מעיל לשמירה על SCz-aNSCs כמו בשכבה או 18 מ"מ coverslips עבור immunostaining, דגירה אותם עם אש"ף לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף אותם 3 פעמים עם DH 2 O. אפשר הצלחות ו coverslips להתייבש אחרי הכביסה האחרונה.
- לאחר מכן, דגירה צלחות עם laminin לילה בשעה 4 ° C. לאחר מכן, לשטוף אותם 3 פעמים עם DH 2 O.
זהירות: אל לייבש את laminin, אשר ישפיע מצורף התא.
הערה: פתרונות הציפוי ניתן לעשות שימוש חוזר 3 פעמים.
בידוד דיסוציאציה 2. למבוגרים SCz
- לפני הכנת תרבות, למקם את מטריקס המוח גילוח פיפיות על הקרח.
הערה: אין להקפיא מטריצת המוח, משום brAin יכול לצרף אליו. - הקורבן עכבר (8 שבועות) בחנק CO 2 או נקע בצוואר הרחם.
- חותך את הראש במספריים חדים לאחר ריסוס 70% אתנול. כדי לשתק את הראש, להחזיק בשני צידי הראש בחוזקה. חותכים את העור עם מספריים על קו האמצע לכיוון הזנב-מקורי. זה מקדם את הסרה מלאה של העור מהגולגולת.
- הסר את חלק הזנב של גולגולת (אחורי למבדה) ראשונה, ולאחר מכן הכנס את המלקחיים בין הגולגולת והמוח במיקום קו אמצע הגבה. תפוס שמאל (או ימין) עצם הקודקוד ובזהירות לקלף אותו. חזור על הליך זה עבור הסרת עצם הקודקוד האחר.
הערה: ניתוק של עצב הראייה והסרת קרומי המוח מהמוח להקל לנתק את המוח מהגולגולת. - מעבירים את המוח למאגר קר PBS (25 מ"ל) ולשטוף אותו פעמיים כדי להסיר דם עודף.
- מניח את המוח לתוך מטריצת המוח על קרח make חתכי עטרה להשיג 1 מ"מ פרוסות עבות. מעבירים את פרוסות המוח (1 מ"מ) הכוללים את האזורים SCz הממוקמים בחלק האחורי של המוח על PBS קר בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ.
זהירות: כדי להשיג מטוס מקביל סעיפי עטרה, להבטיח כי בקע המוח יוצב קו האמצע של מטריקס המוח; זה קריטי כדי למנוע וריאציות מיותר בסעיפים.
הערה: קבל פרוסות מוח אחורי 2-3 מ"מ עד גבחת; זה מאפשר הפרדה בין SCz מן SVZ. - תחת המיקרוסקופ לנתח עם בהגדלה נמוכה, מיקרו-לנתח את SCz מאזור בחומר הלבן של קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם 6,9 מחט 30G מכופף. לאחר מכן, להסיר את האזורים בקליפה מעל SCz. מניח את אזור SCz גזור מן הפרוסות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ על קרח בלי קר PBS.
הערה: זיהום של אזורים נוספים המכילים נוירונים בוגרים יכול להשפיע על הכדאיות של aNSCs ו- B היווצרות neurosphereecause שהם עוברים מוות של תאים בתנאי תרבות aNSC. - באמצעות מחט כפוף 30 G, מייד לקצוץ הרקמות הגזורות לחתיכות קטנות.
הערה: אם זמן רב יותר נדרש לנתח את רקמת SCz, לטבול את הרקמות הגזורות בקור PBS לפני החיתוך. - Re- להשעות את רקמת קצוץ עם 1 מ"ל של חיץ העיכול, להעביר את רקמת לצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של חיץ העיכול, דגירה אותו במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
הערה: יש לנער את הצינור כל 10 דקות לערבב היטב.
3. Subcallosal אזור נגזרות תרבית תאי גזע בוגרים העצביים
- לחץ על הצינור במתינות כדי לנתק את הרקמה מתעכלת, ולאחר מכן צנטריפוגות הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant, מחדש תלויה הרקמה מתעכל עם 1 מ"ל של מדיום מראש חימם N2 לשטוף את החיץ העיכול, בעדינות pipet הפתרון מדגם מקסימום 5 פעמים בעזרת פיפטה P1000.
הערה: Over-triturating עם צרטיפ pipet יכול להפחית כדאיויות תא הצמיחה הבאה. - צנטריפוגה הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. לאחר השלכת supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של מדיום N2.
- הכן 1 מ"ל של מדיום N2 בצלחת 6-היטב שאינו מצופה ולהוסיף 1 מ"ל של תאים מושעה לעשות נפח סופי של 2 מ"ל.
- להוסיף EGF (20 ng / ml) ו bFGF (20 ng / ml) לתוך כל טוב. הנער בעדינות את מנת תרבות 6 היטב ביד לערבב את גורמי הגדילה הוסיפו עם התאים המצופים. שמור את צלחת 6-היטב באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- להוסיף EGF (20 ng / ml) ו bFGF (20 ng / ml) זה טוב כל יום במשך 8 ימים. כל יום שלישי, להוסיף 200 μl של התקשורת N2 כדי לשמור על נפח 2 מ"ל המשוער של המדיום.
4. Passaging של NSCs כמו Neurospheres וכדי תרבויות חד שכבתי
- אסוף את neurospheres ולהעבירם צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
הערה: מספר neurospheres (> 50 מיקרומטר קוטר) PEr היטב מן SCz של מוח עכבר אחת היה 64.3 ± 7.31, אשר היה פחות מזה של SVZ (190.5 ± 6.33) 9. - דגירה neurospheres עם 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק למשך 5 דקות באמבט מים 37 ° C כדי לנתק את neurospheres לתוך תאים בודדים. ניתן ניתק neurospheres הראשי לתוך תאים בודדים ומתוחזק על קטעים מספר תרבויות neurosphere או בשכבה.
הערה: הרחבת SCz-aNSCs כמו בשכבה עדיפה על neurospheres כי SCz-aNSCs ניתן passaged> 10 פעמים במתכונת תרבות בשכבה, אבל <5 פעמים במתכונת תרבות neurosphere.
זהירות: SCz-aNSCs להפגין צבירה חזקה, וקשה לנתק אותם לתוך תאים בודדים. לכן, פורמט תרבות neurosphere אינו מומלץ הרחבת תא שיגרתית. - בעדינות pipet הפתרון המדגם מעלה ומטה עם טפטפת P1000 פחות מ -5 פעמים צנטריפוגות את הצינור ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש suלבלות את neurospheres עם 1 מ"ל של מדיום N2.
הערה: מעל triturating עם קצה פיפטה צר יכול להפחית כדאיויות תא הצמיחה הבאה. - כדי לספור את התאים, לעשות 1: תערובת 1 של השעית התא (10 μl) והפתרון הכחול 0.4% trypan, ולאחר מכן לספור את מספר תאי חיים על hematocytometer. לאחר ציפוי צלחת 6-היטב עם אש"ף / laminin, צלחת התאים ב 2.5 x 10 מ"ל 5 תאים / עם 2 מ"ל של מדיום N2 עבור כל טוב.
הערה: שינויי צפיפות תאים יכולים להשפיע על המצב ופוטנציאל בידול שלהם. - שמירה על SCz-aNSCs עם טיפול יומי של גורמי גדילה (2 מ"ל, 20 ng / ml) במשך 5 ימים, ואת אותם מעבר להם.
בידול 5. Subcallosal אזור שמקורם בתאי גזע בוגרים עצביים
- ANSCs פלייט על coverslip מ"מ 18 מצופה Laminin אש"ף / עם 1 x 10 מ"ל 5 תאים / מ"ל 1 N2 עם גורמי גדילה (20 ng / ml) עבור בידול של-aNSCs SCz.
- היום שאחרי,כשהתאים מחוברים היטב coverslip, להחליף את מדיום הגידול עם N2 להסיר את גורמי הגדילה.
- לאחר 6 ימים, לשטוף את התאים הבדיל עם 1 מ"ל של PBS להסיר פסולת התא ולתקן אותם עבור immunostaining.
הערה: BrdU ניתן לשלב את ה- DNA החדש המסונתז של תאים מתרבים. לכן, אם רוצים, BrdU (10 מיקרוגרם / מ"ל) ניתן להוסיף לחיות התאים לפני קיבוע של תאים.
6. בתאי גזע Immunostaining למבוגרים עצביים בדיל אבות
- עבור immunostaining, לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותן עם PFA 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
זהירות: PFA היא רעילה ביותר; להימנע ממגע עם העור והעיניים. - הסר את 4% PFA, לשטוף את התאים קבוע עם PBS 3 פעמים, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° Cuntil הם נדרשים עבור immunostaining.
- דגירה התאים על coverslip עם פתרון חסימה (אלבומין בסרום שור 3% ו -0.1% Triton X-100 ב 1x PBS) למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
- הכן את הנוגדנים העיקריים בפתרון חסימה טרי דגירת דגימות הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- Immunostaining aNSCs
- הכתם aNSCs באמצעות אנטי Nestin ונוגדנים נגד BrdU. לפני קיבעון, להוסיף 20 מיקרוגרם של BrdU אל aNSCs דגירה אותם עבור 2 שעות. בצע את הצעד denaturing באמצעות 2 N HCl למשך 20 דקות ב 37 מעלות Cbefore שתבצע את הפעולה חוסם.
- Immunostaining אבות הבדיל:
- השתמש אנטי-O4, אנטי bIII טובולין, וחלבון חומצי fibrillary אנטי גליה (GFAP) נוגדנים לתייג את האבות המובחנים.
- Immunostaining aNSCs
- שטפו את דגימות עם 3 פעמים PBS דגירה אותם עם נוגדנים משני מצומדות כדי צבעי ניאון (1: 500) בחסימת פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את דגימות 3 פעמים עם PBS.
הערה: נוגדנים משני השתמש התואמים את המארחים של בפריימריזנוגדנים. Hoechest33343 (1: 2,000) משמש מכתים גרעיני. - הוסף פתרון גובר זכוכית שקופית והמשך עם הרכבה. שימו ותמונה המדגם על מיקרוסקופ confocal באורכי גל מרובים: FITC (488 ננומטר), Cy3 (543 ננומטר), Cy5 (647 ננומטר), ו Hoechest33343 (405 ננומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגדרת מערכת התרבות עבור aNSCs מאזור נוירוגנית ידוע חיונית להבנת התאים הללו לפיתוח פוטנציאל השימוש שלהם במוח תיקון 12. זה ידוע כי NSCs בשלבים התפתחותיים שונים או באזורים שונים מתנהגים בצורה שונה 3,4. לאחרונה, דווח כי נגזרות תאי SCz להפגין פוטנציאלי הפרש לבידול עצבי in vivo ו במבחנה לעומת תאי שמקורם SVZ 7-9. לכן, כדי לבודד כל אזור נוירוגנית בדיוק, פרוסות מוח הכוללות את SCz נותחו באמצעות מטריצת מוח 1 מ"מ (איור 1 א). לאחר 8 ימים של תרבות עם גורמי גדילה, aNSCs נגזר SCz יכול ליצור neurospheres, שבו התאים יכולים להישמר לאחר מכן (1B איור).
מאז משנה של NSCs ב neurospheres עשוי להיות SPOntaneously הבדיל 13, מערכת התרבות monolayer הוא גם מועיל לשמירה על אוכלוסיה הומוגנית יחסית של SCz-aNSCs. גורמי גדילה ואנזימים דיסוציאציה כגון טריפסין לא מחלחלים פנימה עמוק בקלות של neurosphere 14,15. תרבויות חד שכבתי לספק תנאים אפילו יותר להרחבת NSCs. מ neurospheres העיקרי, SCz-aNSCs היו ניתק לתוך תאים בודדים ידי טיפול חיץ העיכול. יום אחד לאחר זריעת תאים, aNSCs צורף הצלחת המצופית ובחלוקה של תאים הציגה (איור 2 א). כדי לאשר העוצמה של שגשוגם, BrdU נוספה לתוך התקשורת. לאחר הדגרה עם BrdU עבור שעה 2, התאים היו מוכתמות בקלות עם אנטי BrdU (סמן התפשטות) ואנטי-Nestin (סמן בתאי גזע עצביים) נוגדנים, המציין כי SCz-aNSCs הם מתרבים באופן פעיל שמירה על המאפיינים העיקריים של תאי גזע (איור 2 ב). בהתאם לכך, הם לא עשו זאת exhibit סמנים עבור תאים מובחנים, כגון EGFR (לידי ביטוי בתאים זמני-הגברה) ו DCX (ביטוי neuroblasts) (איור 2 ג).
כדי לאשר את פוטנציאל הבידול המרובה של SCz-aNSCs, גורמי גדילה הוצאו מן התקשורת והתרבות. לאחר 6 ימים, תאים היו immunostained עם מקבלים שונים עבור תאים מובחנים. כדי להפגין את progenies השונה של aNSCs, סמנים נוירונים (Tuj1), האסטרוציטים (GFAP), ו oligodendrocytes (O4) הועסקו; כל סוגי תאים אלה נוצרו מן SCz-aNSCs (איור 3).
איור 1: בידוד של האזור SCz היווצרות של neurosphere. נוהל (א) לנתיחה של אזור SCz ממוח העכבר הבוגר. כדי בתרבות SCz-ANגיל, מוח עכבר 8 שבועות בן מושם על מטריצת מוח (1 מ"מ במרווחים). לאחר חתך, מ"מ 1 פרוסות המוח, שכללה את אזור SCz (2-3 מ"מ מן גבחת) נותחו (מסומן על ידי קו מקווקו אדום). (ב) היווצרות neurosphere. שמונה ימים לאחר בתרבות חוץ גופית, neurospheres העיקרי (מעבר 0) נוצרו passaged. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תחזוקה של SCz-aNSCs כתרבות בשכבה. (א) יום אחד לאחר זריעת התאים הגזורים, SCz-aNSCs צורף והרחיב על צלחת מצופית באופן בשכבה (משמאל). שלושה ימים לאחר תחזוקה, מספר SCz-aNSCs הוגדל (מימין). (BImmunostaining) עם BrdU (אדום, סמן מתרבים תאים), Nestin (ירוק, סמן בתאי גזע עצביים), ו Hoechest33343 (כחול, סמן גרעינים). (C) Immunostaining עם גזע עצביים / סמנים תא אב Nestin (אדום, סמן בתאי גזע מסוג B עצביים), EGFR (ירוק, סמן תאים מסוג C הגברת חולף), ו DCX (כחול, סמן סוג neuroblasts). גרעינים היו counterstained עם Hoechest33343 (לבן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Immunostaining של תאים מובחנים מן SCz-aNSCs. Immunostaining עם סמנים בידול Tuj1 (ירוק, סמן נוירונים בשלה), O4 (אדום, סמן oligodendrocytes), ו GFAP (לצעוקow, סמן האסטרוציטים). תמונות מוגדלות מוצגות ריבועים. Hoechest33343 (כחול) שימש מכתים ללא מרשם הגרעינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצור NSCs מן SCz עכבר בוגר ולשמור אותם ליישומים שונים. ישנם שלושה שלבים קריטיים להקמת מערכת התרבות חוץ גופית צורך לטהר ולהרחיב SCz-NSCs. ראשית, חשוב להבטיח שאזור SCz הוא גזור החוצה בדיוק מאזורים נוירוגנית פוטנציאליים אחרים (איור 1 ב). חלקים עבים ומדויקים המכילים את אזורי SCz התקבלו עם מטריקס מוח 1 מ"מ מרווח, ולאחר מכן מחט דקה שמשה את דיסקציה מייקרו של SCz מאזורים קליפת מוח אחרים (איור 1 א). כאשר הלא-NSCs מרקמות סמוכות, כגון קליפת המוח, הם מתורבתים עם SCz-aNSCs, מוות קטסטרופלי מתרחשת, אשר משפיע לרעה על יכולת הקיום-היווצרות בתחום SCz-NSCs 16-18,22. SCz הזנב (posterior 2-3 מ"מ עד גבחת) אושר כאזור הטוב ביותר להפקה SCz-aNSCs הברור. שנית, appropטיפול אנזימטי riate בשלבי קציר passaging הוא קריטי להשגת תשואה גבוהה של תאים. Dispase השנייה פפאין היו יעילים יותר לבידוד aNSCs מ טריפסין. דיסוציאציה של תאים עבור passaging עם חיץ דיסוציאציה במקום טריפסין משופרת הכדאיות שלהם 19. דיסוציאציה טחינה דקה מכני עם טפטפת צריכה להיות מינימלית. שלישית, מסנן תא משמש בדרך כלל במערכות תרבות העיקריות להסיר פסולת הסלולר לאחר עיכול רקמות. עם זאת, בשל הלוקליזציה של SCz-aNSCs, תאים אלה מתקבלים לאחר השבירה של חומר לבן על ידי עיכול אנזים טחינה דק מכאנית. במהלך סינון עם מסננת תא, כמות משמעותית של תא תהיה אבודה. לכן, culturing SCz-aNSCs מבלי להשתמש מסננת תא הוא דרך טובה יותר כדי לקבל תשואה גבוהה של תאים.
בעוד שני תרבויות neurosphere ותרבויות monolayer יכולים להיות מיושמות על התחזוקה של NSCs, מגבלה אחת של נוירוהתרבות במרחב היא האחת NSCs ניתקה לאחר הפיצול ניתן לצבור באופן אקראי. תוצאות הצבירה בגדלים שונים של neurospheres. כאשר בגודל של neurosphere מגיע לערך קריטי מסוים, neurosphere גדל כמבנה הטרוגנית, בשל חוסר של חומרים מזינים, גורמי גדילה, וחמצן בליבה 20. יתר על כן, neurospheres עם במידות גדולות אינם ניתק בקלות עם חיץ דיסוציאציה ודורש יותר פעמי טיפול אנזימטי עם טחינה דקה מכאנית נרחבת, מה שמוביל כדאיויות תא תחתונות. לכן, מערכת התרבות monolayer מומלץ לשמור SCz-aNSCs דרך מעברים מרובים. במערכת התרבות monolayer, aNSCs נשמרות ביציבות כמו NSCs (מסוג B) ללא התמיינות ספונטנית לתוך התאים שצוינו, כגון אבות (סוגים C ו- A) (איור 3 א). SCz-aNSCs היו passaged לתקופות ממושכות, <5 קטעים בפורמט neurosphere ו> 10 קטעים כמו בשכבה. זהו וחסרונותistent עם תוצאות קודמות, אשר מראות כי מערכת תרבות monolayer שומרת NSCs במבחנה בתרבויות לטווח ארוך 21. עם זאת, את המהירות מתרבה ירד, ואת החלק של תאים מתים עלה מעל 5 קטעים. Passaging Extended משפיע על multipotency והבחנה עצבית עם סטייה כרומוזום מוגברת 22. לכן, כדי למנוע תופעות passaging ממושכות, מומלץ להשתמש פרקים מוקדמים (<מעבר 5) תאים עבור התפשטות וניתוח בידול. למרות פוטנציאל התחדשות עצמית של SCz-aNSCs דומה SVZ-aNSCs, פחות בידול עצבי הוצג SCz-aNSCs 9.
שיטות לבידוד aNSCs מאזורים נוירוגנית של המוח המבוגר, כולל SVZ ואת gyrus משוננת (DG), הוקמו 22. למרות פרוטוקולים כגון קידמו את הבידוד וטיפוח aNSCs במבחנה, יש מספר מגבלות קבלת מספר גבוה שלתאים. פרוטוקולים רבים לנצל מסוק רקמת מוח עלול לגרום לאיבוד רקמת המוח במהלך הליך החיתוך. גישה נוספת לבודד aNSCs מאזורים נוירוגנית משתמש חתך העטרה דרך המוח באמצעות אזמל. זה ואחריו את דיסקציה מיקרו של SVZ או של DG לאורך הבקע האורך 23. הנוכחות של אזורי מוח אחרים יכולה לגרום סוגי תאים אחרים כדי לזהם את תרבות aNSC, אשר עלול להשפיע על יכולת הקיום של התאים במבחנה. עם הפרוטוקול הנוכחי, מדגמים שונים רבים ניתן לנהל בניסוי יחיד, לרבות בקרות מול מגוון של קבוצות ניסוי. כמו כן, חיתוך באמצעות מטריצת מוח עדיף על כלי חיתוך המוח, שכן היא מאפשרת השגת NSCs מאזורים שונים במוח עם תשואת תא גבוהה. הוא גם מאפשר השוואה של aNSCs מאזורים שונים של אותו מוח.
השתלת והנדסה של NSCs אנדוגני כבר considereד כמו אסטרטגיות אפשריות עבור טיפול בתאי גזע. לשם כך, במבחנה על המאפיינים של aNSCs צריכה גם להיחקר באופן מקיף. לכן, ההקמה היטב מאופיינת במערכת התרבות חוץ גופייה תהיה מועילה לקידום היישום של NSCs. במערכת התרבות הזאת, את המאפיינים-תאי גזע של SCz-aNSCs היו מתוחזק היטב, כפי שמעידים התחדשות עצמית והבחנת מרובי שושלת תחת התנאים המתאימים. לכן, מערכת ההתרבות זה יכול לשמש להרחבת SCz-aNSCs למחקרים ביולוגיים ויישומים טיפוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
