Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen
Summary
Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.
Abstract
Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).
Introduction
Ischemie-reperfusie schade (IRI) treedt op wanneer er een voorbijgaande hypoxie als gevolg van de obstructie van de bloedstroom (ischemie), gevolgd door een latere re-oxygenatie van weefsels (reperfusie). In de huid wordt ischemie-reperfusie (IR) beschouwd als een van de factoren die bijdragen aan de pathofysiologie van decubitus, waarbij langdurige bedrust predisponeert langdurige ziekenhuispatiënten om letsel. Bij deze patiënten wordt zowel de huid en de onderliggende spieren voortdurend blootgesteld aan gewicht uitgeoefende druk over gebieden van botuitsteeksel, waardoor gelokaliseerde verwondingen die, indien onbehandeld, kan necrotisch 1 worden.
De betrokken bij een IRI schade zijn tweeledig. Tijdens ischemie, de occlusie van bloedvaten leidt tot een drastische daling van zuurstofafgifte aan de weefsels. Dit resulteert in een daling van ATP en pH, die ATPasen betrokken celstofwisseling inactiveert. Op zijn beurt, de cellulaire calcium niveaus spike, en gestrest of beschadigde cells ondergaan apoptose of necrose 2. De afgifte van intracellulaire inhoud of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMP), zoals HMGB1 bijdraagt aan de ontstekingsreactie 3. De tweede belediging optreedt tijdens reperfusie. Hoewel zuurstof en pH-niveaus worden hersteld tijdens reperfusie resulteert in de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die leidt tot de oxidatie van intracellulaire lipiden, DNA en eiwitten. Dientengevolge zijn pro-inflammatoire mediatoren geactiveerd, dat een secundair ontstekingsreactie die de rekrutering van immuuncellen naar de ontstekingsplaats 2 omvat vertrekt. Terwijl de cascade van biochemische gebeurtenissen die leidden tot de ontstekingsreactie is goed beschreven, worden de ruimtelijke en temporele regulatie van het immuunsysteem cel activiteiten niet goed begrepen.
Hier beschrijven we een robuuste IR-model op de muis oor huid met behulp van eenvoudige magneet klemmen. In combinatie met multifoton intravitale beeldvorming (MP-IVM), wewerd een model voor de in vivo ontstekingsreacties die na reperfusie plaatsvindt bestuderen. De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om te proberen te begrijpen hoe zowel de interstitiële en infiltrerende cellen reageren op IR in real time.
Bestaande modellen van IR behulp van de stel- techniek op de huid flank zijn sterk invasieve mocht de chirurgische implantatie van staalplaten in de huid flank vereist, waardoor ze minder dan ideaal voor immunologische studies 4. Een dergelijke niet-invasieve klemming techniek is beschreven in de muizenhuid flank 5,6. Vanwege de integratie van de intravitale beeldvorming component in deze werkwijze, maar wij kozen voor de oorhuid de beoogde IR site, zoals omzeilt bewegingen door ademhaling en stabiliteit biedt tijdens beeldvorming 7,8. Bovendien leukocyten subsets de interstitium overspannen zijn identiek tussen het oor huid en de huid flank, hoewel degetallen en verhoudingen kunnen enigszins variëren 9. Dus de oorhuid vertegenwoordigt een ideale beeldvorming plaats.
Daarnaast hebben de meeste gegevens uit deze IRI modellen zijn beperkt tot macroscopische evaluaties (grading van zweren) en microscopische analyses van endpoint inflammatoire indicatoren 10. Met behulp van dit model wordt real-time visualisatie van de cellulaire respons van neutrofielen na reperfusie in de huid van een tl-reporter muis ingeschakeld. Een eerder gepubliceerd intravitale oor imagingmodel wordt gebruikt 8 met extra modificaties (figuren 1, 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Betekenis
IR is een van de belangrijkste oorzaken van de huid decubitus. De vroege stadia (I en II) van decubitus beschrijft de toestand van de menselijke huid (ten opzichte van de onderliggende onderhuidse weefsels en spieren). Echter, is een begrip van de immunologische etiologie ontbreekt nog. Hier presenteren we een eenvoudige en robuuste IR model op muis oorhuid om deze in te lopen. We simuleren ischemie door het klemmen van de muis oor tussen twee magneten en vervolgens de studie van de d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thomas Graf for providing us with the LysM-eGFP mice.
Materials
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel’s updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
