Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

Summary

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

1. Preparação de Formulações Peptide-Based Preparar soluções de estoque de cada péptido como se segue: (KH) 9 -BP100 (1 mg / mL ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) e (BP100) 2 K 8 (70 uM). Pesa-se a quantidade necessária de cada péptido num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar água ultrapura autoclavada para dissolver o péptido. Misturar bem por pipetagem repetida até se obter uma solução límpida. Amplificar e purificar o plasmídeo de ADN (pADN), ADN de cadeia dupla (dsDNA) e ARN de cadeia dupla (ARNcd) de acordo com metodologias moleculares padrão. Em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, fazer soluções de reserva com uma concentração de 1 mg / ml (pADN e dsDNA) ou 400 nM (ARNcd). Preparar a solução da proteína com uma concentração de 7 uM, através da dissolução de 1 mg de proteína (por ex., Álcool-desidrogenase, ADH) em pó em 1 ml de solução de carbonato de sódio (0,1 M, pH 9). Marcar a proteína com fsondas luorescent tais como rodamina B (RhB) de acordo com protocolos convencionais para permitir a visualização microscópica da proteína entregue nas células. Combinam-se as respectivas componentes num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para formulações de péptido-pADN segmentação do citoplasma, adicionar 6,4 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 773.6 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão nuclear (P35S-RLuc-TNOS, Tabela 1). Para formulações de péptido-pADN segmentação da mitocôndria, adicionar 6,6 mL de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C e, em seguida, adicionar 2,4 mL de BP100 (1 mg / ml). Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 256; C, durante mais 15 min. Adicionar 771 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão mitocondrial (pDONR-COX2: rluc, Tabela 1). Para formulações de péptido-dsDNA, adicionar 5,1 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) e 8 ul de ADNcd (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 786.9 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Para formulações de péptido-dsRNA, adicionar 50 ul de (KH) 9 -BP100 (800 nm) para 50 ul de ARNdc (400 nM) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 700 uL de água sem RNase para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Para formulações de péptido-proteína, adicionar 16 ul de (BP100) 2 K 8 (70 uM) a 16 ul de ADH (7 uM) e misturarbem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 768 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Permitir que as formulações para estabilizar durante 15 min a 25 ° C. 2. Caracterização das formulações Peptide-Based Transfira cada solução (800 mL) numa cuvete para análise dinâmica de espalhamento de luz (DLS). Determinar o diâmetro hidrodinâmico e polidispersidade índice dos complexos formados com um Nanosizer zeta, usando um 633 nm do laser de He-Ne a 25 ° C com um ângulo de detecção de retrodifusão de 173 °. Na sequência de medições de tamanho, transferência de cada solução (800 ul) para uma célula capilar dobrado para medições de potencial zeta em parâmetros padrão de constante dieléctrica, índice de refracção e a viscosidade da água a 25 ° C. Observar um pequeno volume da solução do complexo, utilizado para a análise de DLS, por microscopia de força atómica (AFM). Depósito de 10 ul de solução de complexo sobre a superfície recém exposta clivado de uma folha de mica e deixar a mica ao ar durante a noite seca num prato de petri de plástico coberta. Adquirir uma imagem dos complexos em ar a 25 ° C, utilizando um braço de suporte de silício com uma constante de 1,3 N / m mola em modo tapping 27,28. 3. A infiltração das folhas das plantas Use plantas cultivadas em solo velhos 3 semana (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou choupo 26). Transfectar pelo menos 3 folhas de servir como triplicado, para a quantificação da expressão de genes ou a entrega de proteína. Carregar uma seringa de plástico de 1 ml sem agulha com 100 ul de solução do complexo, para a transfecção de uma folha. Posicionar a ponta da seringa na superfície abaxial da folha. Pressione a ponta da seringa contra a folha ligeiramente e pressionar o êmbolo da seringa lentamente enquanto exerce uma contra-pressão com a idedo NDEX de uma mão de látex de luvas do lado oposto. infiltração bem sucedida pode ser observado como o espalhamento de uma área embebido em água na folha. Rotular as folhas infiltradas para facilitar a identificação. Incubar a folha transfectado para durações optimizadas seguinte infiltração com péptido-pADN (12 hr), o péptido-dsADN (12 hr), o péptido-ARNcd – formulações (9 48 h) e péptido-proteína (6 h) sob as seguintes condições: 16 luz hr / 8 h escuro, a 22 ° C para A. thaliana e álamo, ou luz constante 24 horas a 29 ° C para N. benthamiana. 4. Avaliação da eficiência de transfecção Extirpar toda a folha transfectadas de plantas menores (por exemplo., A. thaliana) ou uma secção de 1 cm2 da região infiltrada por plantas maiores (por exemplo., N. benthamiana). Para as experiências de transfecção utilizando a luciferase da Renilla (Rluc) vector repórter, determinar a transfectioN eficiência quantitativamente usando um Kit de Ensaio Rluc. Colocar cada folha excisada ou secção da folha em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 uL de 1 x tampão de ensaio de Rluc lise por tubo. Do mesmo modo, preparar lisados ​​de folhas de controlo não transfectadas (em triplicado). Moer a folha usando um pilão de homogeneização e incubar o lisado resultante a 25 ° C durante 6-10 h. Centrifugar o lisado a 12.470 x g numa microcentrífuga durante 1 minuto. Transferir 20 uL do ligado clarificado para um poço de uma microplaca de 96 poços, e utilizar o volume remanescente para quantificação da concentração total de proteína usando um kit de ensaio de BCA proteína de acordo com o protocolo do fabricante. Adicionar 100 ul de 1 × Rluc Assay Substrate (diluídas usando o Tampão de Ensaio Rluc) para o poço e mistura por pipetagem lenta. Coloque a microplaca num leitor de microplacas multimodo e iniciar a medição. Subtrair a luminescência de fundo (média do nãoN-transfectadas triplicado) de luminescência de cada amostra experimental. Calcular a proporção de fotoluminescência (unidades de luz relativa, RLU) para a quantidade de proteína (mg). Para experiências de transfecção utilizando proteína fluorescente (GFP) vector repórter verde ou proteína fluorescente etiquetado (por exemplo., ADH-RhB), observar a fluorescência usando um microscópio confocal de varrimento laser. Corte as bordas de uma folha inteira (para auxiliar a remoção dos espaços de ar), enquanto uma folha em corte pode ser utilizado tal e qual. Retirar o êmbolo de uma seringa de 10 ml e colocar cada secção da folha ou folha excisada na seringa. Substituir o êmbolo e empurrá-lo suavemente para o fundo da seringa sem esmagamento da folha. Tirar água para a seringa até que seja cerca de metade cheio. Aponte a seringa para cima e empurre o êmbolo para remover o ar da seringa através da ponta. Cobrir a ponta da seringa e puxar lentamente o êmbolo para expelir o ar a partir da Leaf. Repita esse processo várias vezes até que a folha aparece translúcida. Cobrir a superfície de uma lâmina de microscópio com fita adesiva. Cortar uma área quadrada na fita suficientemente grande para acomodar a amostra da folha usando uma lâmina, e retire a peça quadrada de fita adesiva com uma pinça para criar uma câmara de amostra. A fita irá servir como um espaçador entre a lâmina e lamela. Coloque a folha na câmara com a superfície abaxial para cima e virado para preencher a área da câmara com água restante. Selar a folha no interior da câmara com uma lamela de vidro e para fixar as bordas da lamela com fita adesiva. Examine a amostra de folha utilizando o microscópio confocal de varrimento laser sob uma objetiva de 40X ou uma objetiva de imersão 63X de água. GFP ou RhB fluorescência pode ser visualizado em comprimentos de onda de excitação de 488 nm ou 555 nm, respectivamente.

Representative Results

Uma matriz de cargas de ácidos nucleicos e de proteína foram introduzidas com sucesso em diferentes plantas utilizando os péptidos designados como vectores de entrega. Interacções electrostáticas entre cargas e péptidos catiónicos carregados negativamente, resultou na formação de complexos de transfecção que pode ser directamente infiltrada em folhas de plantas utilizando uma seringa sem agulha (Figura 1). (Formulações optimizadas empiricamente determinadas nestes estudos 21,23-26) para a transfecção de células de planta estão listados na Tabela 1, em que cada tipo de uma vasta gama de cargas entregues (pADN, dsDNA, dsRNA e proteína) é representado. Os diâmetros médios de todas as formulações à base de péptidos estavam no intervalo de aproximadamente 150-300 nm. Com base na análise de DLS, todas as formulações exibida polidispersidades de tamanho relativamente baixos, o que indica que os agregados de carga de péptido-formados têm uma distribuição de tamanho uniforme. As morfologias decomplexos entre o péptido e pADN (Figura 2A) ou proteína (Figura 2B), em mica, foram fotografadas por AFM. globulares complexos homogéneos foram observadas para ambos os combinações peptídicas-pADN e péptido-proteína, de acordo com os dados a partir de medições de DLS. Em termos de potencial zeta de complexos (Tabela 1), pDNA- e complexos dsDNA derivados tiveram cargas de superfície líquida negativa, enquanto complexos baseados em dsRNA tinha uma carga de superfície quase neutro. complexos de péptido-proteína, por outro lado, foram carregados positivamente. As eficiências de peptídeo-pDNA e formulações peptídeo-dsDNA em mediar a transfecção de A. thaliana ou N. benthamiana como sistemas modelo de plantas foram avaliados quantitativamente como qualitativamente. O ensaio de expressão do gene RLuc foi utilizado para a quantificação dos níveis de expressão do gene (Tabela 1), portanto, para este experimento ou pADNdsDNA que codifica o gene RLuc deve ser utilizado para complexação com os respectivos péptidos veiculares. Usando o (KH) 9 -BP100 / pDNA formulação, a entrega e expressão de pADN dirigido ao núcleo pode ser alcançado depois de um período de incubação de 12 h, com uma RLU / mg valor estimado de cerca de 1 x 10 5. Para entrega direccionada-mitocondrial e expressão de ADNp, uma combinação de péptidos, Cytcox- (KH) 9 e BP100, é necessário para a formação do complexo. Com o mesmo período de incubação de 12 h optimizada, no entanto, um nível muito mais baixo de transfecção (aproximadamente 1 x 10 3 RLU / mg) foi atingida. Enquanto isso, foi necessária período similar de incubação (12 h) e nível de expressão do gene (cerca de 1 × 10 3 RLU / mg) / gravadas para complexos baseados em dsDNA, também formulada usando o (KH) 9 -BP100 peptídeo. As avaliações qualitativas da expressão do gene foram realizadas por observação microscópica directa de folhas tratadas com complexos de preparEd usando pADN ou dsDNA que codifica o gene repórter da GFP. Em células transfectadas com complexos não-alvo de péptido-pADN, difundir fluorescência verde correspondente com expressão da GFP era claramente observado e verificou-se localizar no citosol (Figura 3A). diferenças distintas no padrão de localização de fluorescência da GFP foram evidentes nas células infiltradas com complexos de péptido-pADN-alvejado mitocondriais. Aqui, punctata fluorescência verde que colocalize com o corante mitocondrial era visível, confirmando a especificidade da expressão do gene exclusivamente no compartimento mitocondrial de células (Figura 3B). No caso de formulações de péptido-proteína, a conjugação da carga de proteína (ADH) para um fluoróforo (RhB) vai permitir a visualização da proteína entregue no compartimento intracelular. Dentro de um curto período de incubação de 6 horas, foi encontrada a proteína ADH-RhB (azul) para ser distribuído por todoo citosol e vacúolo das células infiltradas (Figura 3C). Enquanto isso, rápida e eficiente a infra-regulação da expressão de genes pode ser realizada em várias plantas que usam formulações de péptido-dsRNA. No primeiro experimento, folha A. thaliana foi infiltrada com peptídeo-dsRNA complexos para silenciar o gene chalcona sintase (CHS), responsável pela antocianina (pigmento vermelho) biossíntese sob condições de seca. A diferença na aparência de A. thaliana, sob as folhas normais (Figura 3D, um) e as condições de seca (Figura 3D, b) proporcionou um meio fácil avaliar CHS silenciamento utilizando a formulação de péptido-ARNcd optimizado (seta 1 indica a região infiltrada). No segundo experimento, os complexos de péptido-dsRNA foram infiltradas nas folhas de transgênicos A. thaliana que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP). Uma redução aparente na expressão YFP poderia ser visto nas células epidérmicas 9 h post-transfecção (Figura 3E, F). A eficácia da formulação na expressão de gene regulador de baixo em planta de um sistema diferente (choupo, 12 h pós-transfecção) foi também verificada (Figura 3G, H). Figura 1: As formulações à base de péptido para a entrega de ácidos nucleicos e Cargas proteína em plantas vivas. Os péptidos transportadores concebidos consistem de policatiões conjugados com penetrante de células ou sequências de trânsito organelares. Policatiões permitem a ligação e / ou cargas de condensação de carga negativa, bem como de escape do compartimento endossomal seguinte internalização em células. A entrega de cargas em células e, subsequentemente, para organelos específicos é mediada por sequências penetrante celulares e sequências de trânsito organelares, respectivamente. Vários cargas que poderiam ser successfully entregue na planta incluem ácidos nucleicos, tais como pADN, ADNcd e ARNcd, bem como proteínas modelo, como albumina de soro bovino (BSA), álcool desidrogenase (ADH) e de citrino (uma variante de proteína fluorescente amarela). Moléculas bioactivas são capazes de formar complexos de transfecção com conjugados peptidicos através de interacções electrostáticas, que são introduzidos em folhas de plantas pela infiltração de uma seringa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: as morfologias das formulações à base de péptido. (A) AFM amplitude imagem do (KH) 9 -BP100 formulação / pDNA em N / P 0.5. Altura da imagem de AFM de (BP100) 2 K 8 / formulação ADH em rati molar (B)o 10. Reproduzido com a permissão de fontes publicadas 23,24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Avaliação da transfecção de microscópico Eficiências utilizando formulações à base de péptido optimizada. (A) a expressão citosólica GFP (verde), claramente distinto da autofluorescência cloroplasto (vermelho), foi observado nas células de mesófilo esponjosos de A. thaliana infiltrada com folhas (KH) 9 formulação -BP100 / pDNA (N / P de 0,5; 12 hr ). (B) a expressão de GFP (verde) foi detectado na mitocôndria (vermelha) nas células da epiderme da folha de A. thaliana infiltrada com Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulação pADN (N / P de 0,5 para cada peptídeoe; 12 h). imagens ampliadas de mitocôndrias com expressão GFP são apresentados no painel da direita extrema. (C) A entrega do ADH-RhB (azul) para as células mesofílicas esponjosos de A. thaliana folhas mediada por (BP100) 2 K 8 a uma razão molar de péptido / proteína de 10, visualizado 6 horas após a infiltração. (D) da folha de A. thaliana antes (a) e após (b) o tratamento com (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 48 h), o que resultou na supressão da via de biossíntese de antocianina. Uma formulação semelhante contendo GFP5 ARNcd foi infiltrada na folha como controlo negativo (c). As setas 1 e 3 indicam a área infiltrada enquanto setas 2 e 4 indicam a área não infiltrada dentro da folha. (E) A. thaliana folhas que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (F) a fluorescência de YFP diminuída seguinte com infiltração (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 9 h). (G) As folhas de choupo transgénicos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (H) a diminuição da YFP fluorescência após infiltração com (KH) 9 formulação -BP100 / ARNdc (razão molar 2; 12 h). Reproduzido com permissão de fontes publicadas 21,23,24,26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Variação de Peptide-to-DNA (N / P) e os efeitos sobre as propriedades biofísicas de complexos. Com o aumento da razão de péptido para ADN, as formulações à base de péptidos diminuir de tamanho, enquanto a sua transição valores de potencial zeta de negativo para positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Caracterização e avaliação de várias formulações com base em peptídeos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. Tabela 2: Comparação de tecnologias existentes DNA de entrega baseado em Peptide e outros para plantas intactas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussion

As etapas críticas no âmbito do protocolo que foram identificados empiricamente são discutidos. Por infiltração seringa, as formulações com base em peptídeos são introduzidos nos espaços aéreos no interior da folha da planta através do estomas. Para garantir a absorção máxima da solução, o processo de infiltração deve ser realizada quando as plantas são sob condições que são favoráveis à abertura estomática isto é., Fornecidas com água suficiente e durante o período de luz. No que diz respeito à preparação de complexos de transfecção, para formulações que envolvem uma combinação de dois péptidos (para entrega de ADN alvo-mitocondrial), a sequência de adição de cada componente é crucial e não deve ser invertido.

Existem muitas modificações plausível para o procedimento. Uma outra opção para a infiltração de células vegetais é o uso de infiltração por vácuo, que é capaz de introduzir a solução do complexo em plantas inteiras e / ou parciais, incluindo tecidosmeristemas apicais. Para este procedimento alternativo, as plântulas são submersas na solução de transfecção, e com base na pressão gerada pelo vácuo, os complexos de péptido de transporte de carga são forçados através do estomas e para as células vegetais (Yoshizumi, T., dados não publicados).

A expressão do gene transiente, com base em estudos que utilizam células de animais, foi demonstrado que o aumento de concentrações de ADN superiores ^29-31. É importante notar que a proporção de péptido de ADN afecta as propriedades biofísicas (tamanho, carga superficial) de complexos (Figura 4), o que influencia a eficiência da transfecção; Assim, a proporção óptima necessita de ser mantida, mesmo com o aumento da concentração de ADN.

Uma das principais vantagens em utilizar péptidos como um agente de entrega de genes / proteínas é que a sua sequência é passível de ajuste para cumprir uma função desejada. Por exemplo, o domínio de direccionamento mitocondrial do péptido transportador descrito neste pernoy pode ser substituído por sequências cloroplasmático ou peroxisomais-alvo para localização para essas organelas. Enquanto é possível a transformação de cloroplastos em plantas usando vários biolística ^32-34, nem o Agrobacterium, nem o método de biolística poderia introduzir genes para a mitocôndria ou outros organelos além do núcleo (Tabela 2).

Não existem limitações rígidas gama de hospedeiros para a transfecção à base de péptido, ao contrário do método baseado Agrobacterium (Tabela 2). Até agora, as formulações para a transfecção de A. thaliana, N. benthamiana e choupo foram optimizados (Tabela 1), mas o método pode também ser aplicado para a Nicotiana tabacum, cultivar tomate Micro-Tom, arroz (com base em experiências preliminares), e outras plantas mono e dicotiledóneas.

Como, no entanto, não há nenhuma limitação conhecida no tamanho do transgene quando os péptidos são utilizados umvectores de transfecção. Em contraste, as moléculas de ADN grandes têm sido encontrados para reduzir a eficácia de transformação de Agrobacterium métodos mediados por ^35,36, e um limite de tamanho superior para os transgenes de cerca de 200 kb foi avaliado ^37-39. Usando biolística, por outro lado, grandes fragmentos de DNA pode ser cortado durante a preparação ou fornecimento em plantas ^38. Embora nenhum limite superior tenha sido determinada para a transformação biolística até agora, constrangimentos físicos foram encontrados para restringir o tamanho do DNA que pode ser transferido para muito menos do que 150 kb ^40. Os principais benefícios da utilização do sistema à base de péptido para a transferência de genes em comparação com as abordagens actuais funcionem com Agrobacterium ou bombardeamento de microprojécteis, discutidas acima, encontram-se resumidos na Tabela 2.

Existem alguns limitações para este método, tal como está. Em primeiro lugar, direcionados entrega de pDNA para organelas específicas, tais como o mitochondria, foi provado ser possível através de uma simples combinação de, sequências de penetração de células e organelas-trânsito se ligam ao DNA, embora a eficiência foi baixa. expressão do transgene pode ser detectada, por microscopia confocal, apenas numa pequena população de mitocôndria dentro das células. Assim, outras modificações são necessárias para: (i) aumentar a translocação de mais complexos através da membrana celular / organelar, e (ii) melhorar a dissociação e a transferência de pADN do péptido transportador para o organelo alvo para expressão. Em segundo lugar, a utilização deste sistema de entrega de ADN, a expressão transiente de genes repórter exógenos foi conseguida com sucesso no compartimento citosólico e mitocondrial de células. incorporação estável e a expressão dos genes introduzidos no genoma nuclear da planta / organelar não tenham sido ainda estabelecido, no entanto, devido à ausência de estratégias de selecção adequados.

Embora reconhecendo que existem áreas para melhoria ou mais desenvolvimento, a estratégia de derivados de peptídeo descrito aqui permanece uma técnica simples e versátil, que abriu o caminho para a entrega de várias cargas em diversos tipos de plantas.

Materials

(KH)9-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS