Protocol
1. Préparation de Formulations Peptide-Based
- Préparer des solutions mères de chaque peptide comme suit: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) et (BP100) 2 K 8 (70 uM). Peser la quantité requise de chaque peptide dans un tube de 1,5 ml et ajouter de l'eau ultra pure autoclavée pour dissoudre le peptide. Bien mélanger par pipetage répété jusqu'à l'obtention d'une solution limpide.
- Amplifier et purifier l'ADN plasmidique (ADNp), l'ADN double brin (ADNdb), et l'ARN double brin (ARNdb) selon des méthodes moléculaires standards. Dans 1,5 ml microtubes, faire des solutions d'achat d'actions avec une concentration de 1 mg / ml (ADNp et ADNdb) ou 400 nM (ARNdb).
- Préparer la solution de protéine mère avec une concentration de 7 pm, en dissolvant 1 mg de protéine (par ex., L' alcool déshydrogénase, de l' ADH) en poudre dans 1 ml de solution de carbonate de sodium (0,1 M, pH 9). Étiquette de la protéine avec fluorescent sondes telles que la rhodamine B (Rhb) selon des protocoles standards pour permettre la visualisation microscopique de la protéine délivrée dans les cellules.
- Combiner les composants respectifs dans un tube de 1,5 ml.
- Pour les formulations peptide-ADNp ciblant le cytoplasme, ajouter 6,4 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 20 pi de ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 773,6 pi d'eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d'ADNp conçu pour l' expression nucléaire (P35S-Rluc-TNOS, tableau 1).
- Pour des formulations de peptides ciblant ADNp les mitochondries, ajouter 6,6 ul de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) à 20 pi d'ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C, puis on ajoute 2,4 pi de BP100 (1 mg / ml). On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 256; C pendant encore 15 min. Ajouter 771 pl d'eau ultrapure à l'autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d'ADNp conçu pour l' expression mitochondrial (pDONR-COX2: Rluc, tableau 1).
- Pour les formulations peptide-ADNdb, ajouter 5,1 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 8 pi de dsDNA (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 786,9 pi d'eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
- Pour les formulations peptide-ARNdb, ajouter 50 pi de (KH) 9 -BP100 (800 nM) à 50 ul de ARNdb (400 nM) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 700 ul d'eau sans RNase pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
- Pour les formulations peptide-protéine, ajouter 16 pi de (BP100) 2 K 8 (70 uM) à 16 pi d'ADH (7 uM) et mélangerbien par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 768 pl d'eau ultrapure à l'autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
- Laisser les formulations se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C.
2. Caractérisation des Formulations Peptide-Based
- Transférer chaque solution (800 pi) dans une cuvette pour la diffusion de la lumière dynamique (DLS) analyse. Déterminer le diamètre et l'indice de polydispersité hydrodynamique des complexes formés avec un nanosizer zêta, en utilisant un 633 nm laser He-Ne à 25 ° C avec un angle de détection de rétrodiffusion de 173 °.
- Après les mesures de taille, transférer chaque solution (800 pi) dans une cellule capillaire plié pour les mesures du potentiel zêta à des paramètres par défaut de la constante diélectrique, l'indice de réfraction et de la viscosité de l'eau à 25 ° C.
- Observer un petit volume d'une solution complexe, utilisé pour l'analyse DLS, par microscopie à force atomique (AFM). Dépôt de 10 pi de solution complexe sur la surface clivée fraîchement exposée d'une feuille de mica et de laisser le mica à l'air sécher pendant la nuit dans une boîte en plastique de Pétri couverte.
- Acquérir une image des complexes dans l' air à 25 ° C en utilisant un cantilever de silicium avec une constante de ressort de 1,3 N / m en mode 27,28 taraudage.
3. Infiltration des feuilles des plantes
- Utilisez vieilles plantes de sol cultivé 3 semaine (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou peuplier 26). Transfecter au moins 3 feuilles pour servir trois exemplaires pour la quantification de l'expression du gène ou de la délivrance de protéines.
- Charger une seringue de 1 ml sans aiguille en plastique avec 100 pi de solution complexe pour la transfection d'une feuille. Positionner la pointe de la seringue sur la surface abaxiale de la feuille.
- Appuyez sur la pointe de la seringue contre la feuille légèrement et appuyer sur le piston de la seringue lentement tout en exerçant une contre-pression à l'idoigt ndex d'une main de latex gantée du côté opposé. infiltration réussie peut être observé que la diffusion d'une zone imbibée d'eau dans la feuille. Etiqueter les feuilles infiltrées pour faciliter l'identification.
- Incuber la feuille transfectée pour des durées optimisées suivant l'infiltration avec un peptide ADNp (12 h), le peptide-ADN natif (12 h), le peptide-ARNdb - formulations (9 48 hr) et le peptide à la protéine (6 heures) dans les conditions suivantes: 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 22 ° C pour A. thaliana et le peuplier, ou 24 heures de lumière constante à 29 ° C pour N. benthamiana.
4. Évaluation de l'efficacité de transfection
- Exciser la feuille entière transfectée de petites plantes (par ex., A. thaliana) , ou une partie de la zone infiltrée 1 cm 2 pour les installations plus grandes (par ex., N. benthamiana).
- Pour les expériences de transfection utilisant la luciférase de Renilla (Rluc) vecteur rapporteur, déterminer le transfection efficacité quantitative à l'aide d'un kit Rluc Assay.
- Placez chaque feuille excisée ou de la section de la feuille dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Lysis Buffer par tube. De la même manière, préparer des lysats des feuilles témoins non transfectées (en triple).
- Moudre la feuille à l'aide d'un pilon d'homogénéisation et incuber le lysat résultant à 25 ° C pendant 6 à 10 h.
- Centrifuger le lysat à 12 470 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min. Transférer 20 ul du lysat clarifié à un puits dans une microplaque à 96 puits, et utiliser le volume restant pour la quantification de la concentration en protéine totale en utilisant un kit de dosage BCA Protein selon le protocole du fabricant.
- Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Substrate (dilué à l'aide du tampon Rluc Assay) dans le puits et mélanger par pipetage lent. Placer la microplaque dans un lecteur de microplaques multimodes et lancer la mesure.
- Soustraire la luminescence de fond (moyenne du pasn-transfectées triple) de la luminescence de chaque échantillon expérimental. Calculer le rapport de photoluminescence (unités de lumière relative, RLU) à la quantité de protéine (mg).
- Pour les expériences de transfection en utilisant une protéine fluorescente (GFP) vecteur rapporteur vert ou protéine marquée par fluorescence (par exemple., ADH-RhB), observer la fluorescence en utilisant un confocal à balayage laser microscope.
- Couper les bords d'une feuille entière (pour faciliter l'élimination des vides d'air), tandis qu'une feuille sectionnée peut être utilisé tel quel. Retirer le piston d'une seringue de 10 ml et placer chaque article de feuille ou une feuille excisée dans la seringue.
- Remplacer le piston et le pousser doucement vers le fond de la seringue sans écraser la feuille. Dessinez l'eau dans la seringue jusqu'à ce qu'il soit à peu près la moitié rempli.
- Pointez la seringue vers le haut et pousser le piston pour éliminer l'air de la seringue à travers la pointe. Couvrir la pointe de la seringue et tirez doucement le piston pour expulser l'air du IcaF. Répétez cette opération plusieurs fois jusqu'à ce que la feuille apparaît translucide.
- Recouvrir la surface d'une lame de microscope avec un ruban adhésif. Couper un carré sur la bande assez grand pour accueillir l'échantillon de feuille en utilisant une lame, et peler la pièce carrée de bande hors avec une pince pour créer une chambre d'échantillon. La bande servira une entretoise entre la lame et lamelle.
- Placez la feuille dans la chambre avec la surface abaxiale vers le haut et remplir la zone de la chambre restante avec de l'eau. Sceller la feuille à l'intérieur de la chambre avec une lamelle de verre et fixer les bords de la lamelle couvre-objet avec du ruban adhésif.
- Examiner l'échantillon de feuille à l'aide du confocale à balayage laser sous un objectif 40X ou 63X objectif à immersion dans l'eau. GFP ou Rhb fluorescence peuvent être visualisées à des longueurs d'onde d'excitation de 488 nm ou 555 nm, respectivement.
Representative Results
Un tableau de protéines et acides nucléiques cargaisons ont été introduits avec succès dans diverses plantes en utilisant les peptides conçus comme vecteurs de délivrance. Des interactions électrostatiques entre les peptides cationiques et les marchandises chargées négativement ont donné lieu à la formation de complexes de transfection qui peuvent être directement infiltrés dans les feuilles des plantes à l' aide d' une seringue sans aiguille (figure 1). Formulations optimisées (empiriquement déterminées dans ces études 21,23-26) pour la transfection de cellules végétales sont répertoriées dans le tableau 1, où chaque type de la vaste gamme de marchandises livrées (ADNp, ADNdb, ARNdb et de protéines) est représenté. Les diamètres moyens de toutes les formulations à base de peptides étaient dans la gamme approximative de 150-300 nm. Sur la base de l'analyse DLS, toutes les formulations affichées polydispersité relativement faible taille, ce qui indique que les agrégats de peptides cargo formés ont une répartition granulométrique uniforme. Les morphologiescomplexes entre le peptide et ADNp (figure 2A) ou de la protéine (figure 2B), le mica, ont été imagées par AFM. des complexes globulaires homogènes ont été observées pour les deux combinaisons de peptides ADNp et du peptide-protéine, en accord avec les données provenant des mesures DLS. En termes de potentiel zêta des complexes (tableau 1), pDNA- et complexes dsDNA dérivés avaient des charges nettes de surface négative tandis que les complexes à base de ARNdb avaient une charge quasi neutre surface. des complexes peptide-protéine, d'autre part, ont été chargés positivement.
Les rendements de peptide-ADNp et formulations peptide-ADNdb dans la médiation de la transfection de A. thaliana ou N. benthamiana en tant que systèmes modèles de plantes ont été évalués quantitativement et qualitativement. Le dosage de l' expression du gène Rluc a été utilisé pour la quantification des niveaux d'expression des gènes (tableau 1), par conséquent, pour cette expérience ADNp ouADN double brin codant pour le gène Rluc doit être utilisé pour la complexation avec les peptides porteurs respectifs. En utilisant le (KH) 9 -BP100 / formulation de l' ADNp, la livraison et l' expression de l' ADNp nucléaire ciblée peut être atteint, après une période d'incubation de 12 h, avec un RLU / mg valeur estimée d'environ 1 × 10 5. Pour la livraison mitochondriale ciblée et l' expression de l' ADNp, une combinaison de peptides, Cytcox- (KH) , et BP100 9, est nécessaire pour la formation du complexe. Avec la même période d'incubation optimale de 12 heures, cependant, un taux beaucoup plus faible de transfection (environ 1 x 10 3 RLU / mg) a été atteint. Pendant ce temps, la même période d'incubation (12 heures) et le niveau d'expression du gène (environ 1 x 10 3 RLU / mg) ont été nécessaires / enregistrées pour les complexes à base d'ADN double brin, a également formulé en utilisant le (KH) 9 -BP100 peptide. Les évaluations qualitatives de l'expression des gènes ont été réalisées par l'observation microscopique directe de feuilles traitées avec des complexes prépared utilisant ADNp ou dsDNA codant pour le gène rapporteur GFP. Dans les cellules transfectées avec des complexes non ciblés peptide ADNp, diffuse la fluorescence verte correspondant à l' expression de la GFP a été clairement observée et on a trouvé localiser dans le cytosol (figure 3A). nettes différences dans le modèle de localisation de la fluorescence de la GFP étaient évidents dans les cellules infiltrées avec des complexes de peptide-ADNp mitochondriales ciblée. Ici, la fluorescence verte punctiformes qui colocalisent avec le colorant mitochondrial était visible, ce qui confirme la spécificité de l' expression du gène exclusivement dans le compartiment mitochondriale des cellules (figure 3B).
Dans le cas de formulations de peptide-protéine, la conjugaison de la cargaison de la protéine (ADH) à un fluorophore (Rhb) permettra la visualisation de la protéine délivrée dans le compartiment intracellulaire. Au sein d'une courte période d'incubation de 6 heures, la protéine ADH-RhB (bleu) a été trouvé pour être distribué dansle cytosol et la vacuole des cellules infiltrées (figure 3C). Pendant ce temps, une régulation rapide et efficace de l'expression génique peut être réalisée dans diverses plantes en utilisant des formulations de peptides ARNdb. Dans la première expérience, A. thaliana feuille a été infiltrée avec le peptide-ARNdb Complexes pour réduire au silence le gène de la chalcone synthase (CHS) responsable de l' anthocyanine (pigment rouge) biosynthèse dans des conditions de sécheresse. La différence dans l' apparence de A. thaliana laisse sous la normale (Figure 3D, a) et des conditions de sécheresse (Figure 3D, b) fourni un moyen facile d'évaluer le SHC silencieux en utilisant la formulation peptide-ARNdb optimisé (flèche 1 indique la région infiltrée). Dans la deuxième expérience, les complexes de peptide-ARNdb ont été infiltrés dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana transgénique exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP). Une réduction apparente de l'expression YFP peut être vu dans les cellules de l'épiderme 9 h post-transfection (Figure 3E, F). L'efficacité de la formulation dans l' expression du gène de régulation négative dans un système de plante différente (peuplier, 12 heures après la transfection) a également été vérifiée (figure 3G, H).
Figure 1: Formulations à base de peptides pour la livraison de l' acide nucléique et des cargaisons de protéines dans les plantes vivantes.
Les peptides porteurs conçus sont constitués de polycations conjugués à pénétrant cellulaire ou des séquences de transit organites. Polycations permettent la liaison et / ou de la condensation des cargaisons chargées négativement, ainsi que l'évasion du compartiment endosomal suivante intériorisation dans les cellules. Livraison des cargaisons dans des cellules et par la suite à des organites spécifiques est médiée par des séquences de pénétration des cellules et des séquences de transit organites, respectivement. Diverses cargaisons qui pourraient être successfully livrés à l'usine comprennent des acides nucléiques tels que l'ADNp, et ADNdb ARNdb, ainsi que des protéines modèles, comme l'albumine de sérum bovin (BSA), l'alcool déshydrogénase (ADH) et citrin (une variante de la protéine fluorescente jaune). Molécules bioactives sont capables de former des complexes de transfection avec des conjugués peptide par l' intermédiaire d' interactions électrostatiques, qui sont introduits dans les feuilles des plantes par une seringue infiltration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Morphologies des formulations à base de peptides.
(A) AFM amplitude image (KH) 9 -BP100 formulation / ADNp à N / P 0,5. (B) de l' image de la hauteur de l' AFM de (BP100) 2 K 8 / formulation ADH à rati molaireo 10. Reproduit avec la permission de sources 23,24 publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Microscopique Évaluation de Transfection efficacités utilisant Formulations à base de peptides optimisés.
(A) l' expression cytosolique de la GFP (vert), distingue nettement de l' autofluorescence des chloroplastes (rouge), a été observée dans les cellules du mésophylle spongieuses de A. thaliana feuilles infiltrées avec (KH) 9 formulation -BP100 / ADNp (N / P 0,5; 12 h ). (B) expression de la GFP (vert) a été détectée dans les mitochondries (rouge) dans les cellules de l' épiderme de la feuille A. thaliana infiltrée par Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulation ADNp (N / P 0,5 pour chaque peptide; 12 h). images agrandies des mitochondries avec l'expression de la GFP sont présentés dans le panneau extrême droite. (C) La livraison de ADH-RhB (bleu) dans les cellules du mésophylle spongieux de A. thaliana feuilles médiée par (BP100) 2 K 8 à un rapport molaire peptide / protéine de 10, visualisé 6 heures après l'infiltration. (D) feuille A. thaliana avant (a) et après (b) le traitement avec (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 48 h), ce qui a entraîné la suppression de la voie de biosynthèse des anthocyanes. Une formulation similaire contenant GFP5 ARNdb a été infiltré dans la feuille comme contrôle négatif (c). Les flèches 1 et 3 indiquent la zone infiltrée tandis que les flèches 2 et 4 indiquent la zone non infiltrée à l'intérieur de la feuille. (E) A. thaliana laisse exprimer la protéine fluorescente jaune (YFP) et (F) la fluorescence YFP diminuée suivant l' infiltration avec (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 9 h). (G) des feuilles de peuplier transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) et (H) la YFP fluorescence d'infiltration suivante diminuée avec (KH) 9 formulation -BP100 / ARNdb (rapport molaire 2; 12 h). Reproduit avec la permission de sources 21,23,24,26 publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Variation de Peptide-à-ADN (N / P) Ratio et l'effet sur les propriétés biophysiques des Complexes.
Avec l'augmentation de peptide ratio d'ADN, des formulations à base de peptides diminuent en taille alors que leur potentiel zêta des valeurs de transition du négatif au positif./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Caractérisation et évaluation des différentes formulations à base de peptides. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Tableau 2: Comparaison des technologies existantes ADN de livraison Peptide-base et d' autres pour les plantes intactes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Discussion
Les étapes critiques au sein du protocole qui ont été identifiées de façon empirique sont discutées. Par infiltration seringue, les formulations à base de peptides sont introduits dans les espaces aériens à l'intérieur de la feuille de la plante à travers les stomates. Pour assurer l' absorption maximale de la solution, le processus d'infiltration doit être effectuée lorsque les plantes sont dans des conditions qui sont propices à l' ouverture stomatique ie., Fournis avec suffisamment d' eau et pendant la période de lumière. En ce qui concerne la préparation des complexes de transfection, pour les formulations qui impliquent une combinaison de deux peptides (pour la délivrance d'ADN mitochondrial ciblée), la séquence d'addition de chaque composant est essentielle et ne doit pas être inversée.
Il existe de nombreuses modifications vraisemblables de la procédure. Une autre option pour l'infiltration des cellules végétales est l'utilisation d'une infiltration sous vide, qui est capable d'introduire la solution du complexe dans des plantes entières et / ou partielles, y compris les tissusméristème apical. Pour cette procédure alternative, les plants sont submergées dans la solution de transfection, et en fonction de la pression générée par le vide, les complexes de peptide-cargo sont contraints par les stomates et dans les cellules végétales (Yoshizumi, T., données non publiées).
L' expression transitoire du gène, basée sur des études utilisant des cellules animales, a été démontré que l'augmentation des concentrations d' ADN plus élevées avec 29-31. Il est important de noter que le rapport du peptide à l' ADN affecte les propriétés biophysiques (taille, la charge de surface) , des complexes (figure 4), qui influe sur l' efficacité de transfection; Par conséquent, le rapport optimal doit être maintenu, même avec une concentration accrue de l'ADN.
L'un des principaux avantages de l'utilisation des peptides comme un agent de prestation gène / protéine est que sa séquence est prête à accorder à remplir une fonction souhaitée. Par exemple, le domaine de ciblage mitochondrial du peptide de support décrit dans ce ploty peuvent être remplacées par des séquences chloroplastiques ou peroxysomaux ciblage pour la localisation de ces organites. Tandis que la transformation de chloroplastes est possible de plusieurs plantes en utilisant la biolistique 32-34, ni Agrobacterium , ni la méthode biolistique pourraient introduire des gènes dans les mitochondries et autres organites en dehors du noyau (tableau 2).
Il n'y a pas de limitations gamme d' hôtes rigides pour la transfection à base de peptides, à la différence de la méthode à base d' Agrobacterium (tableau 2). Jusqu'à présent, les formulations pour la transfection de A. thaliana, N. benthamiana et le peuplier ont été optimisés (tableau 1), mais la méthode peut également être appliquée pour Nicotiana tabacum, cultivar de tomate micro-Tom, le riz (à partir d'expériences préliminaires) et d'autres plantes mono- et dicotylédones.
Jusqu'à présent, il n'y a pas de limitation connue de la taille du transgène lorsque les peptides sont utilisés, undes vecteurs de transfection. En revanche, les grandes molécules d'ADN ont été trouvés pour réduire l'efficacité de transformation médiées par Agrobacterium méthodes 35,36, et une limite de taille supérieure pour les transgènes d'environ 200 kb a été rapportée 37-39. En utilisant la biolistique, d'autre part, de grands fragments d'ADN peuvent être cisaillées lors de la préparation ou de la livraison dans des plantes 38. Bien qu'aucune limite supérieure n'a été déterminée pour une transformation biolistique jusqu'à présent, des contraintes physiques ont été trouvées pour limiter la taille de l' ADN qui peut être transféré à moins de 150 kb 40. Les principaux avantages de l' utilisation du système à base de peptides pour le transfert de gènes par rapport aux approches existantes employant soit Agrobacterium ou le bombardement de microprojectiles, discutées ci - dessus, sont résumés dans le tableau 2.
Quelques limitations existent pour cette méthode telle qu'elle est. En premier lieu, la livraison de l'ADNp ciblé vers des organites spécifiques, tels que la mitochondria, a été prouvée possible par une simple combinaison de séquences de pénétration des cellules et un organite transit liaison à l'ADN, bien que l'efficacité a été faible. L'expression du transgène peut être détectée, par microscopie confocale, seule une petite population de cellules au sein de la mitochondrie. Par conséquent, d'autres modifications sont nécessaires pour: (i) améliorer la translocation des plus complexes à travers la cellule / membrane des organites, et (ii) améliorer la dissociation et le transfert de ADNp du peptide porteur dans l'organite cible pour l'expression. En second lieu, l'utilisation de ce système de délivrance d'ADN, l'expression transitoire des gènes rapporteurs exogènes a été atteint avec succès dans le compartiment cytosolique et mitochondriale des cellules. incorporation stable et l'expression des gènes introduits dans le nucléaire de la plante / génome organites ont pas encore été établie mais, en raison de l'absence de stratégies de sélection appropriés.
Tout en reconnaissant qu'il existe des zones d'amélioration ou encore développement, la stratégie de peptide dérivé décrit ici reste une technique simple et polyvalent qui a ouvert la voie à la livraison de divers cargaisons en types de plantes diverses.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le financement du Japan Science and Technology Agency recherche exploratoire pour la technologie avancée (JST-ERATO), la Nouvelle Energie et Industrial Technology Development Organization (NEDO), et le Programme de promotion de l'innovation stratégique Croix-ministérielle (SIP), le Japon .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 ml and 10 ml Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
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