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El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir Published: January 19, 2017 doi: 10.3791/54977

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Vidhya Kumar¹, Henry Chang¹, David A. Reiter², David P. Bradley³, Martha Belury⁴, Shana E. McCormack⁵, Subha V. Raman¹

¹Davis Heart and Lung Research Institute, The Ohio State University, ²Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, ³Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, The Ohio State University, ⁴Department of Human Sciences, Human Nutrition, The Ohio State University, ⁵Division of Endocrinology and Diabetes, Department of Pediatrics, University of Pennsylvania

Introduction

El objetivo de este trabajo es describir un método reproducible para medir de forma no invasiva in vivo la función mitocondrial en el músculo esquelético en individuos que poseen una amplia gama de habilidades. deterioro mitocondrial aberrante es un sello distintivo de una amplia gama de síndromes metabólicos y enfermedades genéticas, de las condiciones comunes como el envejecimiento y la diabetes a enfermedades raras tales como la ataxia de Friedreich.

Síndrome metabólico y disfunción mitocondrial

El síndrome metabólico se ha demostrado que alteran la función mitocondrial, deprimir la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, y dar lugar a almacenamiento de lípidos ectópico en el músculo esquelético ^{^1,} ^2. Como orgánulos críticos que regulan metabólica y la homeostasis de la energía, las mitocondrias están implicados en la fisiopatología de la obesidad ^{^3,} ^4, ⁵ resistencia a la insulina (DM2) ^{^6,} ^7, relacionadas con la diabetes micro ^{^8,} ^{^9,} ^{^10,} ¹¹ y macrovasculares ^{^12,} ^13, y no alcohólicas hígado graso (NAFLD) ^{^14,} ^{^15,} ^16, entre otros .Insulin resistencia se caracteriza por profundos cambios en la actividad mitocondrial del músculo esquelético, incluyendo disminución de la frecuencia mitocondrial de los ácidos tricarboxílicos (TCA) de flujo, tasa de síntesis de ATP y citrato sintasa y NADH: _O2 actividad oxidorreductasa ^5. Una hipótesis es que estas alteraciones podrían deberse a la acumulación de metabolitos de ácidos grasos libres (AGL) en el músculo, que se aumentan notablemente durante la obesidad y otra obesidad-renfermedades eufóricos ^{^2,} ^17. La exposición de músculo para AGL elevados y productos intermedios de lípidos puede disminuir la expresión de genes en la vía oxidativa de los lípidos, así como el ciclo de TCA y la cadena de transporte de electrones (ETC) ^18. Esta reducción de la capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial del músculo esquelético en la fijación de una sobrecarga de lípidos se acompaña de una disminución en el cuantitativo (contenido y la biogénesis de las mitocondrias) ¹⁹ y la función cualitativa de las mitocondrias del músculo esquelético ^20. La exposición de los miocitos del músculo esquelético y de ácidos grasos libres conduce a la resistencia grave a la insulina, y aumento de la captación de FFA en el músculo está asociada con resistencia a la insulina en los seres humanos y roedores ^21. La ceramida intermedios de lípidos y diacilglicerol (DAG) han demostrado inhibir directamente la vía de señalización de la insulina mediante la alteración de la actividad de quinasas, como la proteína quinasa C y protein quinasa B ^21. Por lo tanto, las moléculas de derivados de lípidos parecen desempeñar un papel destacado en el desarrollo de la resistencia a la insulina del esqueleto muscular y DM2. Sin embargo, no queda claro si los cambios en la capacidad mitocondrial son una causa o una consecuencia de la resistencia a la insulina ^22.

La disfunción mitocondrial y la Ataxia de Friedrich

Disminución de la fosforilación oxidativa también pueden surgir de defectos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), la forma más común de ataxia hereditaria, es un trastorno genético provocado por una mutación en el frataxina (FXN) de genes, lo que resulta en la acumulación de hierro intra-mitocondrial, la producción de especies reactivas de oxígeno, y las anormalidades de la fosforilación oxidativa ^{^23,} ^{^24,} ^{^25,} ^26. Este importante descubrimiento ha conducido al desarrollo de terapias dirigidas, which objetivo de mejorar la función mitocondrial a nivel subcelular. A pesar de este conocimiento, ha habido un desarrollo limitado de in vivo, marcadores biológicos reproducibles para la investigación clínica FA. De hecho, una barrera crítica en la evaluación efectiva de las terapias dirigidas en FA es la incapacidad para realizar un seguimiento de los cambios en la función mitocondrial. medidas funcionales actuales, por ejemplo, puede identificar disminución del gasto cardíaco; sin embargo, son incapaces de determinar el nivel en el que se produce la disfunción (Figura 1). El desarrollo de un marcador fiable de la función mitocondrial que puede ser utilizado para identificar y evaluar la progresión de la enfermedad en la ataxia de Friedrich es crucial para calibrar el impacto mecánico correspondiente de terapias dirigidas.

Deterioro de la fosforilación oxidativa y la disfunción cardíaca

la función mitocondrial aberrante, ya sea adquirida o genética, podría contribuir al desarrollo o la progresión de cardidisfunción ac. En las condiciones de sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca, los interruptores de preferencia de sustrato de energía primaria de FFA a la glucosa. Esto se asocia con una disminución de la actividad de ETC y la fosforilación oxidativa ^27. La fisiopatología de la bioenergética mitocondrial en la disfunción cardíaca puede ser diferente dependiendo del origen primario del defecto mitocondrial. La diabetes y el síndrome metabólico resulta en alteraciones mitocondriales en el miocardio, como la biogénesis deteriorado y el metabolismo de los ácidos grasos, los cuales conducen a la reducida flexibilidad de soportes, la eficiencia energética, y, finalmente, la disfunción diastólica ^{^28,} ^29. En FA, por otro lado, una deficiencia de frataxina resultado en la acumulación de hierro mitocondrial significativa en cardiomiocitos ^{^30,} ^31. La acumulación de hierro conduce a la producción de radicales libres a través de la reacción de Fenton ^{32 <}/ Sup> y aumenta la probabilidad de daño de los cardiomiocitos inducida por radicales. La acumulación de hierro Intra-mitocondrial también se asocia con un aumento de la sensibilidad al estrés oxidativo y una capacidad oxidativa reducida ^{^30,} ^31. La acumulación de hierro y la posterior función mitocondrial aberrante, debido a la deficiencia de frataxina, por lo tanto, pueden ser responsables de la energética cardíacas y alteraciones observadas en la miocardiopatía FA ^{^33,} ^34. También es interesante notar que la capacidad oxidativa reducida en las mitocondrias del músculo esquelético es paralela a la intolerancia al ejercicio y reducción de la capacidad metabólica en la insuficiencia cardíaca (HF) ^35. Medición de la capacidad de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético, como se detalla en el presente documento, es fácilmente implementable y robusto; junto con la importancia de la fosforilación oxidativa del músculo esquelético en la IC, estas características lo convierten en un atractivo biomarcador en estudios completos sobre los oyenenfermedad t ^36.

La fosforilación oxidativa y la alteración de la disfunción cardíaca acompañante no es un aspecto insignificante del metabolismo y enfermedad mitocondrial. Los sujetos con diabetes y enfermedades metabólicas están en un riesgo mayor de desarrollar enfermedades cardiovasculares y tienen exceso de mortalidad después de un infarto de miocardio (IM) ^{^37,} ^{^38,} ^{^39,} ^{^40,} ^41; más de la mitad de los sujetos con AF tienen cardiomiopatía, y muchos mueren de arritmia cardíaca o insuficiencia cardíaca ^42. Por lo tanto, la cuantificación de la reducción de la fosforilación oxidativa no sólo podría permitir la detección y el tratamiento de la disfunción cardiaca temprana, pero también podría aliviar una carga importante clínica en estas enfermedades.

Las terapias dirigidas a aumentar directamente la capacidad de la fosforilación oxidativa es un área prometedora para mejorar el tratamiento de sujetos, cuando planeesTher la causa de la disfunción metabólica es genética o adquirida. En la actualidad, el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos a dianas que, o bien alivian la función mitocondrial anormal ⁴³ o corregir el defecto genético primario ⁴⁴ puede mejorar la característica bioenergética trastornada de la FA. En el caso de la disfunción mitocondrial adquirido, el aumento de la actividad física puede mejorar mitocondrial función ^{^45,} ^{^46,} ^47.

³¹ El fósforo Espectroscopia de Resonancia Magnética como biomarcador no invasivo de la función mitocondrial

Independientemente de la terapia de la prueba, un sistema integrado de evaluación in vivo de la bioenergética del músculo esquelético es una herramienta fundamental para evaluar el impacto de las intervenciones dirigidas, sobre todo en sujetos con intolerancia al ejercicio intenso o la incapacidad para someterse a metabo convencionallas pruebas lic. Espectroscopia de resonancia magnética sintonizado a fósforo ⁽³¹ PMRS), un núcleo endógeno encontrado en varios sustratos de alta energía dentro de las células en todo el cuerpo, se ha utilizado para cuantificar la capacidad oxidativa mitocondrial usando una variedad de enfoques, incluyendo en-imán protocolos de ejercicio de recuperación y protocolos de estimulación muscular ^48. Los protocolos de ejercicios de recuperación dependen de una variedad de aparatos que van en complejidad desde ergómetros compatibles con resonancia magnética que regulan y miden la carga de trabajo para configuraciones simples de las correas y las almohadillas que permiten tipo de ráfaga-resistivo y el ejercicio cuasi-estática. Uno de los objetivos principales de cualquiera de estos protocolos es producir un desequilibrio energético para los que se cumple inicialmente la demanda de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la descomposición enzimática de la fosfocreatina (PCr) a través de la reacción de la creatina quinasa ^49. Tras el cese de ejercicio, la tasa de producción de ATP está dominado por pho oxidativosphorylation y representa el máximo de la capacidad in vivo de la mitocondria ^50. Por otra parte, la fosforilación oxidativa durante la recuperación después del ejercicio puede describirse mediante una reacción de velocidad de primer orden ^51. Por tanto, la recuperación post-ejercicio de la PCR puede ser cuantificado mediante la instalación de una constante de tiempo exponencial (τ _PCR), con menores valores de τ _PCr que representan una mayor capacidad para la síntesis de ATP oxidativo. Se han hecho esfuerzos significativos para validar ³¹ PMRS contra ex vivo y medidas más directas de la fosforilación oxidativa y demostrar el potencial de aplicabilidad clínica de esta técnica ^{^52,} ^{^53,} ^{^54,} ^55.

En particular, el protocolo descrito en este trabajo se puede implementar en escáneres clínicamente disponibles, y que ha sido ampliamente validado como un biomarcador no invasivo of la función mitocondrial ^56. Sin embargo, un protocolo de ejercicio PMRS ³¹ optimizado para su aplicación a los individuos con diferentes niveles de gravedad de la discapacidad neuromuscular o la movilidad no ha sido bien establecida ^57. A, protocolo de ejercicio ampliamente aplicable bien definido y ³¹ técnica PMRS serían particularmente útiles en la evaluación de las enfermedades con anomalías fundamentales en la función mitocondrial.

Varios estudios anteriores han explorado las aplicaciones de las técnicas no invasivas para cuantificar la función mitocondrial en sujetos. Por ejemplo, estas técnicas han demostrado la fosforilación oxidativa alterada en sujetos con diabetes tipo 2 ^36. Lodi et al. primero probado la viabilidad de las técnicas de PMRS en sujetos con FA y se encontró que 1) el defecto genético fundamental en FA afecta la fosforilación oxidativa del músculo esquelético y 2) el número de triplete GAA se repite es inversamente proporcional al músculo esquelético OXPHOS ^33. Más recientemente, Nachbauer et al. PMRS utiliza como una medida de resultado secundaria en un ensayo de la droga FA con 7 temas. Los tiempos de recuperación de PCR fueron significativamente más largo en comparación con los controles sujetos, reafirmando el trabajo anterior de Lodi y que indica que los efectos de la expresión aberrante de la frataxina en FA puede resultar en una disminución de la capacidad mitocondrial que es detectable usando técnicas PMRS ^58.

Los métodos fiables para definir adecuadamente vivo en función del músculo esquelético en un rentable, y de manera factible y reproducible son críticos para mejorar los resultados de sujetos en una serie de enfermedades que afectan a la función mitocondrial.

Este trabajo describe un procedimiento robusto para la obtención in vivo máxima capacidad oxidativa del músculo esquelético utilizando ³¹ PMRS. El protocolo de ejercicio en-imán es bien tolerado por los individuos que abarcan una amplia gama de física y funcionalismol habilidades y produce a una configuración simplificada sujetos utilizando equipos de bajo costo y ampliamente disponible.

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Protocol

Este protocolo se aprobó por y sigue las directrices de la Junta de Revisión Institucional Universidad Estatal de Ohio para la investigación con sujetos humanos. Es de vital importancia que todos los procedimientos que implican equipos de RM son realizadas por personal debidamente capacitado que se adhieren a los más altos estándares de seguridad MR ^59.

1. Materiales y Preparación

Asegúrese de que todos los materiales necesarios están disponibles antes del experimento (Figura 2).
Conecte la bobina de ^31P en el conector de la bobina en la tabla al final de la mesa de examen más cercano al agujero. Colocar un cojín de espuma triángulo grande cerca de la cabecera de la mesa examen de RM, pero no directamente sobre la bobina ^31P. Coloque una almohada la cabeza en el otro extremo de la mesa de examen de RM, más alejada del orificio, para la comodidad del asunto.

2. Sin perjuicio de la posición (Figura 3a)

Instruir al objeto de estar en posición supina, piesen primer lugar en la tabla de MR. Colocar un cojín de espuma debajo de las rodillas para apoyar la pierna en una posición parcialmente flexionada.
Coloque el sujeto cerca de la parte derecha de la tabla (a la derecha del sujeto) con el fin de centrar el muslo izquierdo como de cerca para el isocentro imán como sea posible, asegurando así la homogeneidad B0 óptima en el músculo del muslo bajo examen. Proporcionar al sujeto con tapones para los oídos y / o auriculares.
Coloque la bobina de RF ³¹ P en los cuádriceps izquierdo en aproximadamente el punto medio entre la rótula y la cabeza del fémur, y asegure a la pierna mediante correas. Coloca la bobina sobre la parte lateral de la pierna, sobre el vasto lateral.
Asegure el aceite de bebé a la cara medial del muslo con las mismas correas usadas para asegurar la bobina a la pierna. Esto facilita la localización de exploración.
Enlazar piernas del sujeto junto con una correa colocada debajo de la bobina y por encima de la rodilla. Asegurar las patas del sujeto a la mesa de MR con estra adicionalps, una encima de la rodilla y una mitad de camino entre la rodilla y el tobillo.
Utilice la guía de luz láser para delinear el centro de la bobina y mover la mesa para el isocentro del imán usando este punto de referencia de centrado.

Protocolo 3. Ejercicio

Explicar al objeto de que el protocolo de ejercicio consta de tres fases: una primera fase, la línea de base; una fase de ejercicio corto, intenso; y una fase de recuperación.
Instruir al sujeto a permanecer inmóvil y relajar sus músculos de las piernas durante la línea base y de recuperación de las fases de la adquisición de espectroscopia con el fin de minimizar los artefactos de movimiento.
Proporcionar una cuenta atrás para el sujeto que indica el comienzo del ejercicio. En este punto, tiene el sujeto iniciar rodilla extensión / flexión como la fuerza y lo más rápidamente posible en contra de la resistencia de las correas.
NOTA: Los músculos cuádriceps se utilizan para mover la pierna inferior izquierda arriba y abajo, hasta que se indique que se detuviera.
Terminar el ejercicio después de una caída de 30%en la altura del pico de PCR.
1. Observar la altura del pico PCr en la ventana del visor de adquisición, y también visualizarla sobre la terminación de la secuencia de ejercicio.
  NOTA: Una pauta general es que un aproximado gota 30% en la altura del pico PCr corresponde a un pico Pi que es 50% de la altura del pico de PCr. Si PCr agotamiento no está ocurriendo lo suficientemente rápido como para alcanzar una caída de 30% durante la fase de ejercicio del examen, fomentar el objeto de lanzar más fuerte o más rápido durante el ejercicio.
  NOTA: La cesación de ejercicio se determina mediante el control de la altura del pico de PCr y duración del ejercicio. Esto puede ocasionar un ligero diferentes duraciones de ejercicio en diferentes pacientes y puede ser valoradas en el análisis.

4. Protocolo de escaneado

Adquirir un localizador tri-plano para verificar la posición correcta del sujeto e identificar la ubicación de la bobina ³¹ P.
NOTA: La secuencia del localizador comienza automáticamente y se centra en la indicado posición utilizando la guía de luz láser (paso 2.9)
Adquirir un segundo localizador tri-avión.
1. Abra la vista de la rebanada en las primeras imágenes del localizador tri-plano.
  NOTA: Este proceso puede ser diferente para diferentes sistemas de software y hardware.
2. Centro y rotar la orientación rebanada haciendo clic izquierdo y la celebración en el grupo de la rebanada. Girar el grupo rebanada. Asegúrese de que la orientación final de las rebanadas coincide con la posición del aceite para bebé.
3. En la ventana de rutina de secuencia, aumentar el número de cortes para cubrir toda la pierna en la imágenes sagitales (Figura 3B) axial y.
Secuencia de espectroscopia ^31P:
1. Utilice los siguientes parámetros de la secuencia de impulsos no localizados a adquirir: TR: 1.000 ms; TE: 0,34 mseg; anchura espectral: 2000 Hz; ángulo de inclinación: 90 grados; puntos de datos adquiridos: 1.024; 4 promedios resultantes en una resolución de tiempo de 1 espectro cada 6 seg.
³¹ P cuña box colocación:
1. El uso de un ratón, arrastrar el segundo imágenes triplane localizador en la ventana de visualización en la parte superior de la pantalla. Arrastre la secuencia de la espectroscopia en la ventana de protocolo y haga doble clic para abrir.
2. Utilice la barra de herramientas para visualizar la posición del voxel cuña (seleccione el rectángulo negro con líneas horizontales). Después de seleccionar esta opción, observar un cuadro verde de las imágenes del localizador.
  NOTA: Este es el voxel cuña.
3. Mueva el voxel haciendo clic izquierdo y manteniendo pulsado el voxel en el centro. Cambiar el tamaño y rotar la orientación del voxel haciendo clic izquierdo y manteniendo pulsado el voxel en la esquina de la caja. Coloque la caja de cuña a fin de asegurar la homogeneidad de campo B0 directamente debajo de la bobina y paralela al plano de los cuádriceps.
  NOTA: Esto es para asegurar cuñas adecuada dentro de la región sensible bajo la bobina, que es el volumen de tejido directamente debajo del centro de la bobina.
4. Utilizar las imágenes tri-plano localizador para identificar el sensitive región de la bobina y ajustar el cuadro de cuña para abarcar esta región dentro del músculo cuádriceps.
  NOTA: La caja de cuña puede ser mayor que el verdadero alcance de la bobina de superficie con el fin de asegurar la homogeneidad B0 dentro del voxel de adquisición de datos (Figura 3c).
5. ³¹ P adquisición de ensayo:
  1. Abra la ventana del visor de adquisición y seleccione el icono de la cabeza de la barra de herramienta de adquisición. Esto permitirá la visualización de la adquisición espectroscopia en tiempo real.
  2. Después de la colocación de la cuña del voxel 31P, ejecute la secuencia para obtener un solo espectro haciendo clic en el botón "Ejecutar" en la parte superior de la ventana de protocolo.
  3. Examinar la calidad de cuñas B0. Observar el espectro resultante en la ventana de adquisición. Observar un pico prominente PCr con centro en 0 ppm y ningún ruido significativo (Figura 4a, izquierda).
    NOTA: Solución de problemas: Si aparece el espectro de ruido, asegúrese de que el cuadro de cuña se coloca dentro del músculo. Anunciosólo el tamaño y la posición de la caja de cuña para mejorar la relación señal-ruido. Repita la adquisición de ensayo, según sea necesario.
  4. Con el fin de ver la altura del pico de PCr, abrir el espectro en la herramienta de espectroscopía ( "Aplicaciones" → "Espectroscopia"). Abra la carpeta del paciente (icono de árbol de carpetas), seleccione el análisis apropiado, y haga doble clic para cargar el espectro.
Imagen T1 antes del ejercicio:
1. Obtener una imagen ponderada en T1 axial una de un único segmento en el centro de una bobina.
³¹ P adquisición antes del ejercicio:
1. Copiar la secuencia desde el paso 4.4 (que produce la mejor calidad espectral) haciendo clic izquierdo y arrastrando la secuencia en la ventana de protocolo. Utilice esta secuencia para todas las mediciones posteriores.
2. En la ventana de rutina de secuencias, aumentar el número de mediciones de 1 a 10. Seleccionar plazo para adquirir 10 mediciones mientras el sujeto está en reposo.
^{31 <}/ Sup> P adquisición de ejercicio:
NOTA: Hacer buena nota de las horas de inicio y fin de ejercicio, ya que esto será importante para el análisis.
1. Resto: Aplicar la configuración de cuña de la consulta anterior y establece la secuencia de adquirir 20 mediciones. Instruir al sujeto para comenzar a patadas tras una cuenta atrás. Instruir al sujeto a permanecer en reposo durante 2 mediciones.
2. Ejercicio: Pida al sujeto para realizar el ejercicio de extensión de la rodilla y 30 segundos (o el tiempo necesario para lograr una disminución del 30% en la amplitud de pico PCR). Después de que el sujeto logra suficiente PCr agotamiento, pedirles que descansar.
³¹ P después del ejercicio adquisiciones:
1. Adquirir un 20 mediciones adicionales en reposo. Asegúrese de que las adquisiciones posteriores al ejercicio comienzan inmediatamente después de la secuencia de ejercicios, sin pausa ni cuñas (Figura 4a, derecha).
  NOTA: La subdivisión de este período de recuperación en dos adquisiciones separadas permite el análisis de la initial 20 espectros dinámico durante la adquisición de la segunda espectros dinámico 20, que permite al operador para evitar la adquisición del período de recuperación completa si el ejercicio necesita ser repetido.
Asegurar la calidad del ejercicio:
1. Comparación de las alturas de los picos de PCr al principio y al final del ejercicio. sesiones de ejercicio de alta calidad resultan en una disminución de ~ 30% en la concentración de PCR.
2. Compruebe que la altura del pico PCr es el mismo en principio de descanso y en el extremo de recuperación (típicamente, <se desea diferencia 10%). Esto asegura que no había pérdida insignificante de homogeneidad de campo durante la adquisición.
  NOTA: Si la avería PCR es insuficiente, o si se ha producido una pérdida de homogeneidad del campo, a continuación, repetir la etapa de ejercicio / recuperación del examen (teniendo cuidado de evitar la fatiga), asegúrese de que la bobina y las correas estén bien sujetos, y se extienden la duración del ejercicio y / o fomentar el ejercicio más vigoroso (Figura 4b).
  NOE: Una comparación de las imágenes obtenidas en los pasos 6 y 11 permite un paso de control de calidad adicional para visualizar cualquier desplazamiento del muslo y la bobina debido al ejercicio, lo que garantiza que el movimiento mínimo se produjo durante el protocolo, lo que podría afectar de manera significativa los datos adquiridos .
Siguiendo imágenes T1 post-ejercicio, repetir el ejercicio pre-axial de imágenes T1 (paso 4.5) utilizando los mismos parámetros de adquisición.
1. Además de agotamiento suficiente de PCr, medir el ejercicio pH final para garantizar que el ejercicio no indujo acidosis del músculo.
2. Realice esto midiendo el desplazamiento químico entre Pi y PCr (delta P _i) y el uso de la siguiente ecuación ^60:
  pH = 6,77 + log [(delta P _i -3,29) / (5,68-delta P _i)]
  NOTA: El pH debe permanecer superior a 6,8 ^61. Si la avería PCR es suficiente, pero el pH es demasiado bajo, repetir la sesión de ejercicio durante un cortoer duración y / o con una intensidad disminuida.
Almacenamiento de datos:
1. Salvar a todos los espectros adquiridos como archivos DICOM y exportarlos para su procesamiento utilizando JMRUI.
2. Si se utiliza un escáner, seleccione todas las adquisiciones de espectroscopia en la ventana "Navigator".
3. En "Aplicaciones", seleccione "Herramientas" → Dicom "Exportar MR Spectroscopy", y guardar los archivos DICOM (*) .dcm en C: / usuario / MedCom / temp / CDROFFLINE
  (La herramienta automáticamente elige esta ubicación).
4. En "transferencia", seleccione "Exportar a fuera de línea." Añadir a la ubicación deseada.

5. Procesamiento de Datos y Análisis ⁶²

Analizar los espectros de RM con el software JMRUI de libre disposición (versión 5.2; http://www.jmrui.eu/).
Apodize y desplazamiento de fase en los espectros para asegurar la uniformidad sobre todos los puntos de tiempo adquiridos (Figura 5). El pico de PCr se centrará unat 0 ppm en los espectros.
Usar el algoritmo AMARES incorporado para cuantificar la amplitud del pico de PCr en cada espectro adquirido. La amplitud de pico representa la concentración de PCr dentro de la región sensible de la bobina de superficie en ese punto de tiempo particular.
En el software de cálculo, trazar las concentraciones de PCr como una función del tiempo de adquisición. Uso de la herramienta integrada de ajuste de la curva de software computacional, se ajusta a los datos del período de recuperación de PCR para la siguiente ecuación ^{^52,} ^63:
Registre los valores de la línea base de PCr ( ), El más bajo de PCR ( ), Y el tiempo de recuperación ( .
Asegúrese de que se cumplen las condiciones apropiadas durante el ejersesión CISE mediante el cálculo del agotamiento de PCr, la diferencia porcentual entre la línea de base PCr y el más bajo de PCR. sesiones de ejercicio ideal dan como resultado un 20 - 50% de agotamiento.
NOTA: La calidad del ajuste de la curva se puede asegurar mediante la verificación de que el valor R ² es mayor que 0,75. R ² valores se calculan automáticamente por el software de adaptación.

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Representative Results

Estudio de reproducibilidad

Seis voluntarios (4 hombres y 2 mujeres, edad media: 24,5 ± 6,2 años) con ningún corazón auto-reporte, metabólico o enfermedad mitocondrial se sometieron a sesiones de ejercicio y Técnica de escaneo ³¹ PMRS se describe en 2 días diferentes dentro de 1 semana para evaluar la técnica reproducibilidad (Figura 6a). Los estudios realizados en voluntarios normales confirman la reproducibilidad del ³¹ estudio PMRS en la cuantificación de la función mitocondrial. Un análisis de Bland-Altman de tiempo de recuperación PCr demuestra una diferencia media ± desviación estándar de 1,03 seg 4,83 y un coeficiente entre-ensayos de variación de 4,66 (Figura 6b). No se requirieron cambios en el protocolo de adquisición o análisis descrito en la sección de métodos para obtener datos de buena calidad, tal como se describe en el paso 4 del protocolo. estas resULTS demuestran la reproducibilidad de las técnicas de adquisición y análisis descritos en este trabajo.

La evaluación técnica de los participantes en no ambulatorio con Ataxia de Friedrich

Cuatro participantes (2 hombres y 2 mujeres, edad media: 35) fueron sometidos a una sola sesión de ejercicio y la técnica de formación de imágenes ³¹ PMRS se describe en este trabajo para evaluar su viabilidad en una población que no pueden moverse con FA. Estos sujetos eran capaces de llevar a cabo los ejercicios de imán para la obtención de agotamiento suficiente de PCr para adaptarse a los parámetros de recuperación que se muestran en el paso 5.6. Sin embargo, los tiempos de ejercicio más largo - se requerían (60 90 seg) para agotar de manera suficiente los niveles de PCR. Además, oscilaciones en todo el ajuste que fueron causadas por la pérdida progresiva del control muscular, que es característica de esta enfermedad, se observó (Figura 7). Para estos subjects, se utilizaron dos tiras resistivas adicionales entre las rodillas y los tobillos, dando un total de tres correas, para limitar el movimiento no deseado. Estos resultados demuestran la viabilidad de la técnica de adquisición y análisis para obtener los tiempos de recuperación de PCr en sujetos no ambulatorios. Sin embargo, las modificaciones necesarias para obtener datos de buena calidad indican que más estudios de evaluación y normalización son necesarias.

Estudio de factibilidad

Nueve voluntarios sin enfermedad cardiovascular y la percepción subjetiva de los 15 sujetos que se refiere a un programa de rehabilitación cardiaca y prevención secundaria (CRSP) se inscribieron en una junta de revisión institucional local (IRB) con aprobación para el estudio. Se obtuvieron unos valores clínicos como indicadores de la salud cardiovascular y la gravedad del síndrome metabólico. La fracción de eyección del ventrículo izquierdo fue preservado en sujetos CRSP (56 10%). la maximo capacidad de ejercicio cardiovascular, medida antes de iniciar CRSP, fue similar en pacientes con y sin diabetes (0,6 frente a 3,4 3,05 0,8 equivalentes metabólicos MET, p = 0,4). Antes de iniciar CRSP, cada sujeto inscrito sometió el ejercicio y Técnica de escaneo ³¹ PMRS, que se describe en este trabajo, y la formación de imágenes cuantificación de grasa intramuscular, se ha descrito previamente ^64. La constante de tiempo de la recuperación de PCR fue más largo (41.9 1,4 frente a 32,1 7,4 seg, p = 0,05), y el porcentaje de grasa intramuscular fue mayor en sujetos CRSP frente a los controles (8,7 2,9 frente a 2,54 0,6%, p <0,001). El porcentaje de grasa intramuscular fue similar en sujetos CRSP con y sin diabetes (p = 0,4), y la constante de tiempo de la recuperación de PCr tendió a ser mayor en los sujetos con diabetes en comparación con aquellos sin diabetes y en los controles (p = 0,03 para las tendencias entre los grupos). seguimiento de los datos preliminares sugieren una mejora en mucho peorMET post-CRSP en sujetos con diabetes en comparación con los que no tienen (delta = 1.0 0.8 4.0 2.4 frente, p = 0,06; Figura 8). Estos resultados demuestran la viabilidad de esta técnica para cuantificar las diferencias en la fosforilación oxidativa del músculo esquelético entre sujetos con y sin enfermedad metabólica conocida.

Figura 1. Las mitocondrias, músculo esquelético, y cardiopulmonar.
se muestra una representación de la relación entre las mitocondrias, el músculo esquelético, el gasto cardíaco, la ventilación, y la capacidad funcional. Reproducido de Milani et al ^65.

Figura 2. Materiales.
Los materiales necesarios incluyen 1) un cojín triángulo, 31 de bobina de transmisión-recepción superficie P-sintonizado, 3) Mesa a la mesa de conexión correas resistivas, 4) una correa resistente de auto-conexión, y 5) una pequeña botella de aceite de bebé. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Posicionamiento.
A) Los sujetos se crean imágenes en una posición supina, los pies por delante. La bobina ³¹ P se coloca en el cuádriceps izquierdo. correas resistivos se colocan por encima y por debajo de la rodilla y unidos a la mesa. Una sola correa se utiliza para enlazar las dos piernas juntas por encima de la rodilla. B) El posicionamiento rebanada se muestra para el segundo localizador. Tenga en cuenta que las rodajas se centran en el locación de la botella de aceite para bebé, y las rodajas de cubrir todo el cuádriceps. C) La colocación de caja de cuña ³¹ PMRS se muestra. Este volumen se coloca directamente debajo de la bobina en el cuádriceps y abarca una profundidad que asegura señal suficiente y cuñas apropiado dentro de la zona de la bobina de superficie.

Figura 4. Adquisición de Datos.
A) Se muestra un representante de la adquisición de ³¹ P en reposo. La PCR es el gran pico simple, y no hay un mínimo de ruido (a la izquierda). Una típica adquisición durante la etapa de ejercicio de los resultados de protocolo en dos grandes picos, Pi y PCR (derecha). A medida que avanza el ejercicio, los picos Pi y PCR aumentará y disminuirá, respectivamente. B) La comparación de la altura del pico de PCr en reposo y después del ejercicio debe revelar al menos una disminución de ~ 30%. este c ÁLCULO se debe hacer en la consola del escáner con el fin de garantizar el éxito del estudio de ejercicio.

Figura 5. Análisis.
Se muestra la corrección de fase y apodization de un espectro representativo. A) Un espectro prima que muestra un pico-un gradual y la presencia de ruido que oscurece los picos. B) Un espectro mostrando 0 ^º - y 1 ^de corrección de fase -order. El pico de PCr se encuentra en la frecuencia central es fácilmente identificable, pero otros picos de metabolitos todavía se oscureció. C) El espectro después de apodización con una forma de la línea de Lorentz, que resulta en una reducción del ruido y una mejor visualización de los 3 picos de ATP y la PDE y el pico de Pi. Este espectro está listo para la cuantificación de pico con la herramienta AMARES. archivos / ftp_upload / 54977 / 54977fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. ³¹ PMRS en sujetos sanos.
A) Esta figura muestra la recuperación de la concentración de la fosfocreatina (PCr) después de su agotamiento con la rápida extensión de la rodilla ejercicio cuasi estática. La línea representa el ajuste de la función de recuperación exponencial descrito en la etapa 5.6, con el tiempo de recuperación τ constante muestra; esta constante de tiempo es un biomarcador bien establecido de la función oxidativa mitocondrial. B) El análisis de Bland y Altman del ³¹ PMRS reproducibilidad técnica demuestra una diferencia media ± desviación estándar de 1,03 4,83 seg para el tiempo de recuperación de PCr entre los ensayos; el coeficiente de variación es 4,66.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54977/54977fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. ³¹ PMRS en sujetos no ambulatorios.
Se muestra una curva de recuperación PCr representante de la ³¹ PMRS examen de un sujeto no ambulatorio. Tenga en cuenta que una PCr agotamiento del 64% se logró con este protocolo de ejercicio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. ³¹ PMRS en sujetos CRSP.
Una comparación de la PCr RECOVery veces demuestra secuencialmente más pobre capacidad oxidativa mitocondrial en control, no diabéticos, y los sujetos diabéticos. Las barras de error representan la desviación estándar.

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Discussion

Este documento describe un protocolo estándar para ³¹ PMRS examen que permite la medición de serie y no invasiva in vivo de la función mitocondrial del músculo esquelético. El protocolo tiene un atractivo considerable cuando se considera la amplitud de las investigaciones dirigidas a la creciente carga de síndrome metabólico y su morbilidad y mortalidad resultante. Este protocolo ³¹ PMRS requiere una cantidad mínima de tiempo escáner y puede ser incorporado en las investigaciones metabólicas completas en sujetos en cualquier centro con instalaciones MRS comercialmente disponibles.

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Contraindications- Antes de MR exámenes, es crucial para detectar sujetos a posibles contraindicaciones. Además de los criterios de exclusión típicos MR, el siguiente debe ser considerado antes de la aplicación de este protocolo: los implantes 1) rodilla ipsilateral o cadera (sin tener en cuenta oCompatibilidad f MR) para evitar artefactos, 2) las condiciones que restringen el flujo sanguíneo o el aporte de oxígeno a las extremidades inferiores (por ejemplo, enfermedad de las arterias, periférica), 3) una incapacidad para realizar ejercicio de extensión de cuádriceps resistiva, y 4) la incapacidad para mentir supino durante aproximadamente 30 min.

Motion artefacto reduccionista El movimiento de la bobina ³¹ P con respecto al cuadriceps del sujeto y el movimiento del muslo del sujeto con relación a la tabla debe ser minimizado. Asegúrese de que la bobina está bien conectado a la pierna del sujeto y que resistivas que las correas estén bien asegurados a la mesa de examen. Prueba de esto asegurándose de que el talón del sujeto aumenta no más de 5 en. Fuera de la mesa de examen durante patadas y que no hay rotación de la bobina durante el ejercicio.

Adquisición

Ejercicio calidad- El sujeto debe ejercer a unaChieve al menos un agotamiento del 30% en la PCR. Para este protocolo, se ha determinado que 30 s de ejercicio para los sujetos ambulatorios y 60 s para sujetos no ambulatorios logra este objetivo. Hemos observado que los sujetos no ambulatorios ejercen menos fuerza por patada y, por tanto, se requiere un intervalo más largo para el agotamiento suficiente.

Análisis- Los métodos descritos aquí proporcionan un marco para minimizar la subjetividad y maximizar la automatización. Selección de los parámetros de entrada del usuario para el análisis de los espectros se debe hacer con cuidado con el fin de asegurar la reproducibilidad.

Modificaciones y solución de problemas

Calidad del espectro- Si aparece el espectro de ruido, asegúrese de que el cuadro de cuña se coloca dentro del músculo. Ajuste el tamaño y la posición de la caja de cuña para mejorar la relación señal-ruido. Repita la adquisición de ensayo, según sea necesario.

Comodad de Ejercicio-Si el ejercicio resultados iniciales en insuficiente agotamiento PCr, hay varias modificaciones que se pueden utilizar para solucionar problemas: 1) las correas puede ser apretado, para aumentar la resistencia; 2) El sujeto puede ser instruido para lanzar más rápido, lo que aumenta el esfuerzo; o 3) la duración del ejercicio sostenido se puede aumentar. Sin embargo, tenga en cuenta que el exceso de ejercicio puede dar lugar a un pH alterado y podría conducir a la acidosis, que puede inhibir la cinética de recuperación de la fosforilación oxidativa ^61. Esto se puede evitar mediante la limitación del tiempo de ejercicio hasta un máximo de 3 min.

Limitaciones de la Técnica

Un análisis de la biopsia muscular permite la medición de las características mitocondriales específicas, tales como el contenido mitocondrial y tamaño, así como la tasa de síntesis de ATP mitocondrial máximo. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la medición in vivo usando ³¹ PMRS representa un agregado de estos dimedidas rect, además de los factores extra-mitocondrial, tales como el suministro microvascular de sangre oxigenada al músculo. Por lo tanto, en situaciones en las que el estado de la microvasculatura es en cuestión debido a la oferta de oxígeno reducida u otros factores, no sería un indicador inequívoco de estado mitocondrial. Más bien, se podría indicar el estado in vivo de la síntesis de ATP oxidativo máximo de los músculos, lo que puede reflejar alguna combinación de la fosforilación oxidativa y las cuestiones microvasculares.

Una limitación del protocolo PMRS ejercicio ³¹ se detalla en este trabajo es la falta de estandarización de la producción de trabajo. Esta falta de estandarización simplifica el aparato requerido, y por lo tanto la aplicación de este protocolo. Sin embargo, se produce a expensas de no permitir la evaluación cuantitativa de otros parámetros, tales como la resistencia y la fatiga, y su relación con las medidas metabólicas. Como resultado de ello, diferentes niveles de esfuerzo podrían afectar la PCrel tiempo de recuperación más allá de la gravedad del defecto mitocondrial subyacente. Uno puede minimizar estos efectos, garantizando suficiente PCr agotamiento y puede normalizar aún más la producción de trabajo mediante el uso de ergómetros compatibles con la RM con la resistencia ajustable y salidas de trabajo medibles.

Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes o alternativos

La capacidad de cuantificar directamente la función mitocondrial en el músculo esquelético es la principal ventaja de la técnica de ³¹ PMRS en comparación con la prueba de esfuerzo metabólico estándar. Biopsia de músculo invasivo proporciona mediciones en las fibras individuales ^66, aunque con los consiguientes riesgos que hacen que sea menos atractivo para las investigaciones que requieran evaluación de serie. Enfoques basados en la espectroscopia de infrarrojo cercano ⁶⁷ pueden estar limitadas por la profundidad de penetración, sobre todo en pacientes obesos, en los que tan poco como 5 mm de grasa atenúa la NIRS signal en un 20% ^68. Además, la técnica no se presta a la evaluación multidimensional del músculo y otros sistemas que ofrece técnicas basadas-MR. Además, a diferencia de los métodos invasivos de biopsia para la cuantificación de la energética muscular, esta medida no invasiva y no destructiva permisos medidas del estado metabólico en el músculo intacto repite, por lo que es ventajoso para la evaluación de las poblaciones de sujetos y las intervenciones terapéuticas.

Las aplicaciones futuras

Posibles aplicaciones después de dominar esta técnica ³¹ PMRS incluyen la evaluación de las enfermedades con defectos mitocondriales específicos o cualquiera de una amplia gama de trastornos metabólicos. En pacientes con pobre rendimiento cardíaco, las técnicas actuales pueden identificar alteración de la capacidad funcional, pero no pueden establecer el nivel en el que se produce la disfunción (por ejemplo, el músculo esquelético, el corazón o los pulmones). Sería especialmenteinteresante para el desarrollo de protocolos integrados que combinan ³¹ PMRS con medidas metabólicas y ensayos cardiopulmonares para identificar las causas de la disminución de la capacidad de temas específicos con el fin de facilitar las terapias personalizadas.

Tenemos ejemplos detallados de terapias dirigidas importantes e intervenciones que se beneficiarían de la utilización de marcadores in vivo de la función mitocondrial. Un ³¹ PMRS protocolo de ejercicio estandarizado, como el que se detalla más arriba, es un paso importante para un uso más generalizado de este marcador importante en vivo de la capacidad mitocondrial del músculo esquelético en ambos estudios básicos y de intervención.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens

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Kumar, V., Chang, H., Reiter, D. A., Bradley, D. P., Belury, M., McCormack, S. E., Raman, S. V. Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (119), e54977, doi:10.3791/54977 (2017).

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