Midbrain संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विश्वसनीय पहचान आरएनए अनुक्रमण और वें प्रमोटर संचालित EGFP अभिव्यक्ति का उपयोग
Summary
पार्किंसंस रोग (पीडी) में, द्रव्य नाइग्रा (एसएनसी) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पतित, मोटर रोग के लिए अग्रणी। यहाँ हम एक माउस EGFP व्यक्त एक tyrosine hydroxylase (ध) प्रमोटर अनुक्रम द्वारा संचालित से उदर मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स संवर्धन, संस्कृतियों से अलग-अलग फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स कटाई, और आरएनए seq का उपयोग कर अपने transcriptome को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट।
Abstract
पार्किंसंस रोग (पीडी) में वहाँ एसएनसी में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की स्पष्ट अध: पतन के साथ मस्तिष्क भर में व्यापक न्यूरोनल घटाने के लिए bradykinesia, कठोरता, और कंपन अग्रणी है। एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग प्राथमिक उदर mesencephalic (वीएम) संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान तय कोशिकाओं के immunostaining पर निर्भर बिना इन न्यूरॉन्स के चुनिंदा असुरक्षा का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। यहाँ, हम अलग, अलग कर देना, और 3 सप्ताह के लिए संस्कृति माउस वीएम न्यूरॉन्स। हम तो EGFP प्रतिदीप्ति (एक tyrosine hydroxylase (ध) प्रमोटर द्वारा संचालित) का उपयोग संस्कृतियों में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स कांच micropipettes का उपयोग कर microcentrifuge ट्यूबों में काटा जाता है। अगला, हम काटा कोशिकाओं lyse, और सीडीएनए संश्लेषण और transposon की मध्यस्थता "tagmentation" का संचालन एकल कक्ष शाही सेना Seq पुस्तकालयों 1, 2 उत्पादन करने के लिए,गधा = "xref"> 3, 4, 5। एक गुणवत्ता नियंत्रण की जांच पारित करने के बाद, एकल कोशिका पुस्तकालयों अनुक्रम कर रहे हैं और बाद के विश्लेषण के जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए किया जाता है। हम व्यक्तिगत डोपामिनर्जिक और मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों से अलग GABAergic न्यूरॉन्स के लिए transcriptome परिणाम की रिपोर्ट। हम रिपोर्ट है कि जी वें EGFP कोशिकाओं है कि काटा और अनुक्रम थे की 100% डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स थे। इन तकनीकों में तंत्रिका विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर आवेदन करना होगा।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक लाइलाज, उम्र से संबंधित neurodegenerative विकार है। इस अपेक्षाकृत आम विकार के कारण समझ खराब रहता है। वहाँ मस्तिष्क भर में व्यापक न्यूरोनल हानि, द्रव्य नाइग्रा (एसएनसी) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की स्पष्ट neuronal अध: पतन के साथ, bradykinesia, कठोरता और कंपन के नैदानिक नैदानिक सुविधाओं के लिए अग्रणी है।
प्राथमिक मिश्रित एसएनसी डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स युक्त संस्कृतियों पार्किंसंस रोग के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं। उदर tegmental क्षेत्र (VTA) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स इनाम और लत में फंसाया गया है। उदर mesencephalic (वीएम) प्राथमिक मिश्रित भ्रूण संस्कृतियों एसएनसी और VTA डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स और GABAergic न्यूरॉन्स दोनों होते हैं। वीएम प्राथमिक संस्कृतियों neuroprotection assays के लिए उपयोगी हो सकता है और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के चुनिंदा असुरक्षा को स्पष्ट करने के लिए। संस्कृति में डोपामिनर्जिक कोशिकाओं आकृति विज्ञान के आधार पर पहचान करने के लिए कोई विश्वसनीय तरीका है। वहफिर हम पहचान करने और फसल एकल डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, और निर्माण एकल कोशिका, उच्च उपज आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों तकनीक का विकास।
हम एकल डोपामिनर्जिक और मध्यमस्तिष्क संस्कृतियों से अलग GABAergic न्यूरॉन्स के लिए प्रतिनिधि आरएनए transcriptome डेटा की रिपोर्ट। इस प्रोटोकॉल डीए / गाबा transcriptome पर विभिन्न उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए neuroprotection, neurodegeneration, और औषधीय assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। क्योंकि डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स प्राथमिक वीएम संस्कृतियों में व्यक्त न्यूरॉन्स के एक छोटे से अल्पसंख्यक प्रतिनिधित्व करते हैं, मज़बूती से रह संस्कृतियों में इन न्यूरॉन्स की पहचान करने की क्षमता एकल कोशिका के अध्ययन के एक बढ़ाया रेंज में सक्षम होगा। ये उपन्यास तकनीक तंत्र सेलुलर स्तर पर जगह लेने को समझने के क्षेत्र में प्रगति की सुविधा होगी और अनुप्रयोगों के तंत्रिका विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान के क्षेत्र में कहीं और हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करें, तो एकल कोशिका शाही सेना seq के साथ प्रत्येक कोशिका का अध्ययन एक विषम आबादी से एकल कक्षों अलग। हम रिपोर्ट है कि जी वें EGFP कोशिकाओं है कि हम काटा और अनुक्रम की 100% निम्न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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