دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في<em> ذبابة الفاكهة</em> المبايض
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
ووصف الميتوكوندريا كلاسيكي باسم قوة الخلوية، لأنها هي المقاعد الرئيسية لإنتاج الطاقة في الخلايا المتمايزة. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في عملية التمثيل الغذائي وتوليد الحرارة، وتعديل الدهون والكالسيوم والتوازن الأكسدة، وتزامن عمليات الخلية إشارات، الخ 1. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا نشطا في تحريض الخلايا الموت 2، وكذلك في خلية تنظيم دورة 3. هذه وظائف متعددة تثير الأسئلة الأساسية التالية: أ) كيف الميتوكوندريا أداء كل هذه المهام في وقت واحد وب) وهناك حمامات الميتوكوندريا محددة أو subzones التي تخصصت لوظائف مختلفة؟ في هذا السياق، من المهم أن نلاحظ أن الميتوكوندريا متعددة الوظائف الحيوية في شكلها وحجمها، وهيكل داخل الخلايا الفردية، وأنه شكل حالة استقرار الميتوكوندريا يمكن أن تختلف بين أنواع الخلايا. عقود من البحث من مختلف مختبروتشير الخطابات أن تغيير شكل الميتوكوندريا وحجم وهيكل، التي تسمى مجتمعة ديناميات الميتوكوندريا، أمر بالغ الأهمية للحفاظ على وظائف مختلفة الميتوكوندريا 4،5،6. هذه النتائج تثير إمكانية أن الميتوكوندريا قد يحقق لها وظائف متعددة بحكم ديناميكية الهيكلية.
جارية لفهم العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا جهود واسعة النطاق. يتم الحفاظ على دينامية هيكل الميتوكوندريا في المقام الأول من خلال قدرتها على الخضوع الانشطار والانصهار الأحداث مع بعضها البعض. انشطار الميتوكوندريا كبيرة تحولها إلى عناصر الميتوكوندريا أصغر، في حين التحام بين مؤسستي الميتوكوندريا أصغر يدمج منهم إلى عنصر الميتوكوندريا أكبر 7. وعلاوة على ذلك، قد يحدث الانصهار عابرة اثنين من الميتوكوندريا للسماح للخلط محتوياتها. تخضع الأحداث الانشطار والانصهار في الأغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية بعناية من قبل المواصفاتيحدد IFIC من البروتينات. ويتكون الجهاز الانشطار الأساسية من البروتين ذات الصلة dynamin 1 (Drp1)، الذي يتم تجنيده من العصارة الخلوية إلى الميتوكوندريا التي كتبها تفاعلها مع بعض الحسنة بروتينات الميتوكوندريا الحسنة (على سبيل المثال، Fis1 أو Mff1)، في حين أن وظيفة Drp1 يمكن أيضا أن ينظم من قبل بروتينات أخرى على سطح الميتوكوندريا 4. على الرغم من أن Drp1 تعمل على الغشاء الخارجي، والقدرات الانشطار لها تؤثر على الغشاء الداخلي كذلك. تزامن للانشطار أغشية الميتوكوندريا الخارجي والداخلي ليست مفهومة جيدا. من ناحية أخرى، يخضع انصهار الغشاء الداخلي في صلب الأنشطة التي يقوم بها Opa1، في حين يحكم mitofusins انصهار الخارجي غشاء 5. التوازن في مواجهة الانشطار والانصهار أحداث الميتوكوندريا تملي شكل الميتوكوندريا حالة استقرار في خلية. على سبيل المثال، فإن القمع الانشطار الميتوكوندريا يؤدي إلى الانصهار الكامل وبدون معارضة، في حين أن الإفراط في النشاط الميتوكوندرياسيكون ل الانشطار يؤدي إلى تفتت الميتوكوندريا 3.
دراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا ينطوي في المقام الأول نهجين مجانية: أ) تحليل الظواهر الخلوية والعضوي بعد التلاعب الجيني للبروتينات الانشطار / الانصهار الميتوكوندريا وب) التقييمات المباشرة للهيكل الميتوكوندريا وظيفة. ومن الجدير بالذكر أن التحاليل الجينية قد لا تكشف دائما وظيفة مباشرة للجزيء في متناول اليد (في هذه الحالة، الميتوكوندريا البروتينات الانشطار / الانصهار)، كما قد تنشأ الظواهر بسبب آثارها الجانبية. ولذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتطوير واستخدام أدوات لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة مباشرة. أي تقييم لهيكل الميتوكوندريا يتضمن أدوات الفحص المجهري مختلف. استخدام المجهر مضان من الخلايا الحية قد تقدم كثيرا من الدراسات ديناميات الميتوكوندريا، منذ ديناميكية الميتوكوندريا يمكن رصدها من حيث الكم وquantitatively باستخدام أدوات وتقنيات 8 مضان المجهر المناسبة. وقد تم تطوير الأدوات التي تعتمد على الفحص المجهري مضان لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في أنسجة البطن الحية والثابتة ذبابة الفاكهة، توضيح أهمية حيوية الميتوكوندريا في الجسم الحي 9. يتم وصف هذه الأساليب وذات الصلة هنا، وذلك بهدف دراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبيض ذبابة الفاكهة.
يتكون المبيض ذبابة الفاكهة من سلالة الجرثومية والجسدية الأنساب، التي تنشأ من الخلايا الجذعية البالغة في كل منها الموجودة في germarium 10،11. ستة عشر الخلايا الجرثومية المخلوي (GCS) الحصول على تغليف بواسطة خلايا بصيلات الجسدية (FCS) لتشكيل غرف البيض الفردية التي تنشأ من germarium (الشكل 1). واحدة من 16 GCS الحصول ملتزمة تصبح بويضة، و15 GCS المتبقية تتطور إلى خلايا الممرضة التي تدعم نمو غرفة بويضة، وتسهيل نضوج البويضة قبل وضعه. الغالبية العظمى من السفح الخضوع 9 جولات من الانقسامات الإنقسامية قبل خروجها من دورة الخلية الإنقسامية للتمييز عضال في طبقة الخلايا الظهارية نمط تتكون من خلايا الأمامي جريب (AFCs)، وخلايا الخلفي بصيلات بالفلور، وخلايا الجسم الرئيسية (MBCS) . يتم توصيل الدوائر البيض على التوالي من قبل خلايا ساق، والتي تتمايز الخلايا التي تستمد أيضا من السفح في وقت مبكر في عملية التنمية. شكل الميتوكوندريا التي تنظمها الميتوكوندريا Drp1 البروتين الانشطار وتشارك بنشاط في عملية التمايز خلال التطور الطبيعي للذبابة الفاكهة المبيض طبقة FC 9،12. ووصف الأساليب المستخدمة في هذه الدراسات للتعرف على إشراك Drp1 في ذبابة الفاكهة تطوير طبقة الخلايا المسام هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
photobleaching من: منع photobleaching من لا مبرر له من عينات الفلورسنت ضروري جدا لأداء كفاءة المجهر متحد البؤر. ولذلك، فإن الوقت المستخدم لتحديد العينات من خلال العدسة أو لتعيين المعلمات الحصول على الصور ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
