Studere Mitokondriel struktur og funktion i<em> Drosophila</em> ovarier
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Mitokondrier er klassisk beskrevet som den cellulære kraftcenter, da de er de vigtigste pladser i energiproduktionen i differentierede celler. Desuden mitokondrier spiller en kritisk rolle i stofskiftet, varmeproduktion, lipid modifikation, calcium og redox homeostase, orkestrering af celle- signalering processer, etc 1. Mitokondrier spiller også en aktiv rolle i induktion af celledød 2, samt i cellecyklus regel 3. Sådanne multifunktionalitet rejser følgende grundlæggende spørgsmål: a) hvordan mitokondrier udføre alle disse funktioner samtidig og b) er der specifikke mitokondrie puljer eller underområder, der er specialiseret til forskellige funktioner? I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at de multifunktionelle mitokondrier er dynamiske i deres form, størrelse og struktur i individuelle celler, og at steady-state form af mitokondrier kan variere mellem celletyper. Årtiers forskning fra forskellige laboratorier tyder på, at ændring af mitokondrie form, størrelse og struktur, samlet kaldes mitokondrie dynamik, er afgørende for at opretholde forskellige mitokondrie funktioner 4,5,6. Disse resultater rejser muligheden for, at mitokondrier kan udføre deres multifunktionalitet i kraft af deres strukturelle dynamik.
Omfattende indsats i gang for at forstå den mitokondrielle struktur-funktion forhold. Dynamikken i mitokondriestruktur primært vedligeholdes af deres evne til at undergå fission og fusion arrangementer med hinanden. Spaltning af store mitokondrier omdanner dem til mindre mitokondrielle elementer, mens fusion mellem to mindre mitokondrier fletter dem i en større mitokondrie element 7. Desuden kan forbigående fusion af to mitokondrier forekomme for at tillade blanding af deres indhold. De fission og fusion begivenhederne i de indre og ydre mitochondriemembraner er omhyggeligt styret af specSp ec ifik sæt af proteiner. Kernen fission maskiner er sammensat af dynamin-relateret protein 1 (Drp1), som er rekrutteret fra cytosolen til mitokondrierne ved dets interaktion med visse bona fide mitokondrielle proteiner (f.eks Fis1 eller MSpol frem1), mens Drp1 funktion også kan reguleres ved andre proteiner på mitokondrie flade 4. Selv Drp1 opererer på den ydre membran, dets fission evner påvirke den indre membran samt. Den orkestrering af fission af ydre og indre mitochondriemembraner er ikke godt forstået. På den anden side er fusion af den indre membran er omfattet kernen af aktiviteterne i Opa1, mens mitofusins regulerer fusion af ydermembranen 5. Den resterende del af de modvirker fission og fusion begivenheder mitokondrier diktere steady-state mitokondrie form i en celle. For eksempel ville undertrykkelse af mitokondrie fission resultere i fuldstændig og enstemmigt fusion, medens overaktivitet af mitokondrierl fission ville resultere i fragmentering af mitokondrier 3.
Studiet af mitokondriestruktur-funktion forhold aktiverer primært to gratis fremgangsmåder: a) analyser af de cellulære og organismal fænotyper efter genetisk manipulation af mitokondrielle fission / fusionsproteiner og b) direkte vurdering af mitokondrisk struktur og funktion. Det er bemærkelsesværdigt, at genetiske analyser ikke altid kan afsløre direkte funktionalitet af molekylet ved hånden (i dette tilfælde, mitokondriske fission / fusionsproteiner), som kan opstå de fænotyper på grund af sekundære virkninger. Derfor er det af største vigtighed at udvikle og anvende værktøjer til at studere mitokondrielle struktur og funktion direkte. Enhver vurdering af mitokondriestruktur involverer forskellige mikroskopi værktøjer. Anvendelse af fluorescens mikroskopi af levende celler har i høj grad avancerede studier af mitokondrie dynamik, da mitokondrie dynamik kan overvåges både kvalitativt og quantitatlukkende at bruge de passende fluorescens mikroskopi værktøjer og teknikker 8. Fluorescensmikroskopi-baserede værktøjer er blevet udviklet til at studere mitokondrielle struktur og funktion i levende og faste Drosophila melanogaster væv, belyse betydningen af mitokondrie dynamik in vivo 9. Disse og beslægtede metoder er beskrevet her, med det mål at studere mitokondrisk struktur og funktion i Drosophila æggestok.
Den Drosophila æggestok består af kimcellelinje og somatiske slægter, som stammer fra deres respektive voksne stamceller, der findes i germarium 10,11. Seksten syncytial kønsceller (GCS) bliver indkapslet af somatiske follikelceller (FCS) for at danne individuelle æg kamre, der dukker op af germarium (figur 1). En af de 16 GCS gå forpligtet til at blive en oocyt, og de resterende 15 GCS udvikle sig til sygeplejerske celler, som understøtter væksten af oocyt kammerLette modningen af ægget, før det er lagt. Størstedelen af FCS undergår 9 runder af mitotiske inddelinger før de forlader den mitotiske cellecyklus til terminalt differentiere til en mønstret epitelcelle lag bestående af forreste follikelceller (AFCs), posterior follikelceller (PFC), og væsentligste kropsceller (MBC'er) . De konsekutive æg kamre er forbundet ved stilk celler, der differentierede celler, der også stammer fra FCS tidligt i udviklingen. Mitokondrie form reguleret af mitokondrie fission protein Drp1 er aktivt involveret i processen med differentiering under den normale udvikling af Drosophila æggestokkene FC lag 9,12. De anvendes i disse undersøgelser for at identificere inddragelsen af Drp1 i Drosophila follicle cellelag udvikling metoder er beskrevet her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Critical Steps within the Protocol
Photobleaching: Preventing undue photobleaching of fluorescent samples is absolutely necessary to performing efficient confocal microscopy. Therefore, the time used to locate samples through the eyepiece or to set image acquisition parameters through the live scanning mode should be minimized to minimize photobleaching.
Tissue damage: Since mitochondria are considered to be the sensors of cellular health, it…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
