में mitochondrial संरचना और समारोह के अध्ययन<em> ड्रोसोफिला</em> अंडाशय
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिष्ठित, सेलुलर महाशक्ति के रूप में वर्णित के बाद से वे विभेदित कोशिकाओं में ऊर्जा उत्पादन का मुख्य सीटें हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया चयापचय, गर्मी पीढ़ी, लिपिड संशोधन, कैल्शियम और redox homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका, सेल संकेत प्रक्रियाओं के आर्केस्ट्रा, आदि 1 खेलते हैं। माइटोकॉन्ड्रिया भी कोशिका चक्र विनियमन 3 में कोशिका मृत्यु 2 की प्रेरण में एक सक्रिय भूमिका है, साथ ही खेलते हैं। ऐसे बहु-कार्यक्षमता निम्नलिखित मौलिक सवाल उठता है: क) माइटोकॉन्ड्रिया इन सभी कार्यों को एक साथ प्रदर्शन करते हैं और ख) विशिष्ट mitochondrial पूल या subzones कि अलग कार्यों के लिए विशेष कर रहे हैं देखते हैं? इस संदर्भ में, यह ध्यान दें कि multifunctional माइटोकॉन्ड्रिया उनके आकार, आकार, और व्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर की संरचना में गतिशील हैं और माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिर राज्य आकार प्रकार की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं कि महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रयोगशाला से अनुसंधान के दशकोंoratories सुझाव है कि mitochondrial आकार, आकार, और संरचना, सामूहिक रूप से कहा जाता है mitochondrial गतिशीलता के परिवर्तन, विभिन्न mitochondrial कार्यों 4,5,6 को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इन निष्कर्षों संभावना है कि माइटोकॉन्ड्रिया उनकी संरचनात्मक गतिशीलता के आधार पर उनकी बहु कार्यक्षमता को पूरा कर सकते हैं बढ़ा।
व्यापक प्रयासों mitochondrial संरचना समारोह संबंधों को समझने के लिए चल रहे हैं। mitochondrial संरचना की गतिशीलता मुख्य रूप से एक दूसरे के साथ विखंडन और संलयन घटनाओं से गुजरना करने के लिए अपनी क्षमता से बनाए रखा है। बड़े माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन, छोटे mitochondrial तत्वों में उन्हें धर्मान्तरित जबकि दो छोटे माइटोकॉन्ड्रिया के बीच विलय के लिए उन्हें एक बड़ा mitochondrial तत्व 7 में विलीन हो जाती। इसके अलावा, दो माइटोकॉन्ड्रिया के क्षणिक संलयन उनकी सामग्री के मिश्रण की अनुमति के लिए हो सकता है। भीतरी और बाहरी mitochondrial झिल्ली के विखंडन और संलयन घटनाओं को ध्यान से कल्पना द्वारा नियंत्रित कर रहे हैंific प्रोटीन का सेट। कोर विखंडन मशीनरी dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) है, जो निश्चित सदाशयी mitochondrial प्रोटीन (जैसे, Fis1 या Mff1) के साथ अपनी बातचीत से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए cytosol से भर्ती है Drp1 समारोह भी द्वारा विनियमित किया जा सकता है, जबकि से बना है mitochondrial सतह 4 पर अन्य प्रोटीन। हालांकि Drp1 बाहरी झिल्ली पर चल रही है, इसके विखंडन क्षमताओं के रूप में अच्छी तरह से भीतर की झिल्ली को प्रभावित। बाहरी और भीतरी mitochondrial झिल्ली के विखंडन के आर्केस्ट्रा में अच्छी तरह से समझ नहीं है। दूसरी ओर, भीतर की झिल्ली के विलय, Opa1 की गतिविधियों से मूल में संचालित होता है, जबकि mitofusins बाहरी झिल्ली 5 के विलय को नियंत्रित। माइटोकॉन्ड्रिया के प्रतिकार विखंडन और संलयन घटनाओं के संतुलन के लिए एक सेल में स्थिर राज्य mitochondrial आकार नियंत्रित करती हैं। उदाहरण के लिए, mitochondrial विखंडन का दमन पूर्ण और निर्विरोध संलयन में नतीजा होगा, जबकि माइटोकॉन्ड्रिया की ओवर-गतिविधिएल विखंडन माइटोकॉन्ड्रिया 3 के विखंडन पर नतीजा होगा।
mitochondrial संरचना समारोह संबंध का अध्ययन मुख्य रूप से दो मानार्थ दृष्टिकोण शामिल है: एक) mitochondrial विखंडन / संलयन प्रोटीन की आनुवंशिक हेरफेर के बाद सेलुलर और जीवधारी phenotypes का विश्लेषण करती है और ख) mitochondrial संरचना और समारोह का सीधा आकलन। ऐसा नहीं है कि आनुवांशिक विश्लेषण हमेशा की तरह, प्रत्यक्ष (इस मामले में, mitochondrial विखंडन / संलयन प्रोटीन में) हाथ में अणु की कार्यक्षमता का खुलासा नहीं कर सकते हैं के रूप में phenotypes माध्यमिक प्रभाव के कारण उत्पन्न हो सकती है उल्लेखनीय है। इसलिए, यह विकसित और सीधे mitochondrial संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए उपकरण का उपयोग करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। mitochondrial संरचना के किसी भी मूल्यांकन के विभिन्न माइक्रोस्कोपी उपकरण शामिल है। जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग बहुत, mitochondrial गतिशीलता के अध्ययन के बाद से उन्नत किया है mitochondrial गतिशीलता दोनों गुणात्मक और quantitat नजर रखी जा सकतीउचित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करते हुए 8 ively। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आधारित उपकरण विवो 9 में mitochondrial गतिशीलता के महत्व का वर्णन रहते हैं और तय ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ऊतकों में mitochondrial संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। ये और संबंधित विधियों यहाँ वर्णित हैं, ड्रोसोफिला अंडाशय में mitochondrial संरचना और समारोह के अध्ययन के लक्ष्य के साथ।
ड्रोसोफिला अंडाशय germline और दैहिक प्रजातियों, जो अपने संबंधित वयस्क स्टेम कोशिकाओं है कि germarium 10,11 में रहते से उठता के होते हैं। सोलह syncytial रोगाणु कोशिकाओं (जेंटलमैन कैडेट) व्यक्तिगत अंडा कक्षों कि germarium (चित्रा 1) के बाहर उभरने के लिए फार्म का दैहिक कूप कोशिकाओं (एफसीएस) द्वारा समझाया मिलता है। 16 जेंटलमैन कैडेट में से एक एक oocyte बनने के लिए प्रतिबद्ध है, और शेष 15 जेंटलमैन कैडेट नर्स कोशिकाओं है कि oocyte चैम्बर के विकास का समर्थन के रूप में विकसित, अंडे की परिपक्वता की सुविधा होने से पहले ही रखी है। एफसी के बहुमत mitotic डिवीजनों में से 9 दौर से गुजरना पहले वे mitotic कोशिका चक्र से बाहर निकलने टर्मिनली पूर्वकाल कूप कोशिकाओं (AFCs), पीछे कूप कोशिकाओं (PFCS और), और मुख्य शरीर की कोशिकाओं से मिलकर एक नमूनों उपकला सेल परत में अंतर करने के लिए (MBCs) । लगातार अंडे कक्षों डंठल कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं को भी है कि प्रारंभिक विकास में एफसी से निकाली गई है भेदभाव कर रहे हैं से जुड़े हुए हैं। Mitochondrial आकार mitochondrial विखंडन प्रोटीन Drp1 द्वारा विनियमित सक्रिय रूप से ड्रोसोफिला डिम्बग्रंथि एफसी परत 9,12 के सामान्य विकास के दौरान भेदभाव करने की प्रक्रिया में शामिल है। ड्रोसोफिला कूप सेल परत विकास में Drp1 की भागीदारी की पहचान करने के लिए इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया तरीकों यहाँ वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
Photobleaching: फ्लोरोसेंट नमूनों की अनुचित photobleaching की रोकथाम बिल्कुल कुशल confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, ऐपिस के माध्यम से नमूने का प…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
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