Studera Mitokondriell struktur och funktion i<em> Drosophila</em> Äggstockar
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Mitokondrier är klassiskt beskrivs som den cellulära kraftpaket, eftersom de är de viktigaste platserna för energiproduktion i differentierade celler. Dessutom, mitokondrierna spela en avgörande roll i ämnesomsättningen, värmealstring, lipid modifiering, kalcium och redox homeostas, orkestreringen av cellsignalering processer, etc 1. Mitokondrier spelar också en aktiv roll i induktionen av celldöd 2, liksom i cellcykelreglering 3. En sådan multifunktionalitet lyfter följande grundläggande frågor: a) Hur mitokondrierna utföra alla dessa funktioner samtidigt och b) är det specifika mitokondriella pooler eller subzones som är specialiserade för olika funktioner? I detta sammanhang är det viktigt att notera att de multifunktionella mitokondrierna är dynamiska i sin form, storlek och struktur inom enskilda celler och att steady-state form av mitokondrier kan variera mellan olika celltyper. Årtionden av forskning från olika labboratorier tyder på att förändringen av mitokondriell form, storlek och struktur, kollektivt kallade mitokondriella dynamik, är avgörande för att upprätthålla olika mitokondriella funktioner 4,5,6. Dessa upptäckter lyfter möjligheten att mitokondrierna kan utföra sin mångsidighet genom sin strukturella dynamik.
Omfattande ansträngningar görs för att förstå den mitokondriella struktur och funktion relation. Dynamiken av mitokondriell struktur primärt upprätthålls av deras förmåga att undergå fission och fusion händelser med varandra. Fission av stora mitokondrier omvandlar dem till mindre mitokondriella element, medan fusion mellan två mindre mitokondrier övergår dem i en större mitokondriell elementet 7. Vidare kan övergående fusion av två mitokondrier inträffar för att tillåta blandning av deras innehåll. Klyvnings och fusionshändelser hos de inre och yttre mitokondriemembranen noggrant styrs av specific uppsättningar av proteiner. Kärnan fission maskiner är sammansatt av dynamin relaterat protein 1 (Drp1), som rekryteras från cytosolen till mitokondrierna genom dess interaktion med vissa bona fide mitokondriella proteiner (t.ex., Fis1 eller MSnabbsp frm1 mSnabbsp), medan Drp1 funktion även kan regleras genom andra proteiner på den mitokondriella ytan 4. Även Drp1 verkar på det yttre membranet, dess klyvnings förmågor påverkar det inre membranet också. Orkestreringen av fission av yttre och inre mitokondriska membranen är inte väl förstådd. Å andra sidan, är sammansmältning av det inre membranet styrs på kärnan av verksamheten i Opa1, medan mitofusins styr fusion av yttre membranet 5. Återstoden av de motverkande fission och fusion händelser mitokondrier diktera steady-state mitokondriell form i en cell. Till exempel, skulle repression av mitokondriell klyvning resultera i fullständig och unopposed fusion, medan överaktivitet av mitokondrierl fission skulle leda till fragmentering av mitokondrier 3.
Studiet av mitokondriell struktur och funktion relation innebär i huvudsak två gratis metoder: a) analyser av de cellulära och organism fenotyper efter genetisk manipulation av mitokondriella fission / fusionsproteiner och b) direkta bedömningar av mitokondriell struktur och funktion. Det är anmärkningsvärt att genetiska analyser inte alltid kan avslöja direkt funktion av molekylen till hands (i det här fallet, mitokondriella fission / fusionsproteiner), eftersom fenotyper kan uppstå på grund av sekundära effekter. Därför är det av yttersta vikt att utveckla och använda verktyg för att studera mitokondriell struktur och funktion direkt. En bedömning av mitokondriell struktur innebär olika mikroskopi verktyg. Användning av fluorescensmikroskopi av levande celler har i hög grad avancerade studier av mitokondriella dynamik, eftersom mitokondriell dynamik kan övervakas både kvalitativt och quantitattivt med användning av lämpliga fluorescensmikroskopi verktyg och tekniker 8. Fluorescensmikroskopi-baserade verktyg har tagits fram för att studera mitokondriell struktur och funktion i levande och fixerade Drosophila melanogaster vävnader, belysa betydelsen av mitokondriell dynamik in vivo 9. Dessa och liknande metoder beskrivs här, med målet att studera mitokondriell struktur och funktion i Drosophila äggstocken.
Drosophila äggstocken består av nedärvda och somatiska linjer, som uppstår från deras respektive adulta stamceller som finns i den germarium 10,11. Sexton syncytialkönsceller (GCS) blir inkapslad av somatiska follikelcellerna (FCS) för att bilda individuella ägg kamrar som framkommer ur den germarium (Figur 1). En av de 16 GC få åtagit sig att bli en äggcell, och de återstående 15 GC utvecklas till sjuksköterska celler som stöder tillväxten av äggcellen kammaren, Underlätta mognaden av ägget innan det läggs. Majoriteten av FC: er undergår 9 omgångar av mitotiska delningar innan de lämnar den mitotiska cellcykeln för att terminalt differentiera till ett mönstrat epitelial cellskikt bestående av främre follikelcellerna (AFCS), posterior follikelcellerna (PFC), och huvudkroppsceller (MBC) . De på varandra följande ägg kamrarna är förbundna genom stjälkceller, vilka är differentierade celler som också är härledda från de FC: er tidigt i utvecklingen. Mitokondriell form regleras av den mitokondriella fission protein Drp1 deltar aktivt i processen för differentiering under den normala utvecklingen av Drosophila äggstocks FC skiktet 9,12. De metoder som används i dessa studier för att identifiera medverkan Drp1 i follikelstimulerande cellskikt Drosophila utveckling beskrivs här.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Fotoblekning: Förhindra otillbörlig fotoblekning av fluorescerande prover är absolut nödvändigt att utföra en effektiv konfokalmikroskopi. Därför bör den tid som används för att lokalisera prover genom okularet eller för att ställa bildupptagning parametrar genom live scanning minimeras för att minimera fotoblekning.
Vävnadsskador: Eftersom mitokondrier anses vara sensorerna av cellulär hälsa, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
