The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
学習は、メモリトレースおよびそれらのメンテナンスの形成に基づきます。広く1根底にあるメカニズムは、ニューロン間の既存のシナプスの連絡先の新規および/または再配置の活性依存形成を表してもよいことが認められています。分子レベルでは、様々なタンパク質修飾、細胞内relocalizationsおよびシナプスタンパク質の代謝回転の変化は1-4(ランプレヒトを、2004#8)に記載されています。しかし、ほとんどの研究は、これまでに選択されたタンパク質ではなく、グローバルが、複雑なシナプスのプロテオーム組成に焦点を当てました。本発明のアプローチは、学習実験後のマウスの脳領域におけるシナプスプロテオームの変更のための公正なスクリーニングを可能にします。シナプスアーキテクチャの学習誘発性の再編成の時点依存性分子のスナップショットをレンダリングするのに適しています。説明ワークフローは、特定の動物の行動の異なる専門家のチームワーク、タンパク質生化学、質量分析およびbioiが必要ですnformatics。
選択された学習パラダイム、 すなわち周波数変調音の弁別(FMTD)は、げっ歯類5でよく特徴付け聴覚弁別課題です。学習と、このシャトルボックスゴー/ノー・ゴー・タスクでの長期記憶の形成は、増加した皮質ドーパミンシグナル伝達およびタンパク質合成に依存の機構を持っています。したがって、スナネズミおよびマウスに関する最近のプロテオミクス研究は、皮質ではなく、おそらくFMTD学習とメモリ6-8の間に相互作用し、より基礎的な脳領域におけるシナプスのコンポーネントのドーパミンと学習誘発性プラスチックの再配列を明らかにしました。これは、メモリの形成は、種々の脳領域の複雑な相互作用に関与し、従って、示差的プロテオームレベルで、これらの領域内で調節されるかもしれないことを示しています。したがって、選択された皮質と皮質下のマウスの脳領域の解剖は、ワークフローに含まれています。
また、信頼性の高いcharacterizatiでも、シナプスタンパク質組成物中の弱変化の上で前とシナプス後コンパートメントの濃縮ではなく、ホモジネートまたは粗膜画分9の分析が必要です。したがって、前のプロテオーム解析に確立されたプロトコルを利用シナプトソームの調製は、検出レベルとシナプス特異的タンパク質10,11のためのダイナミック・レンジを増加させるために記載されています。
定量的な目的のためのラベルフリーの高分解能質量分析を使用するための必須の前提条件は、タンパク質試料の類似度が高いです。ではなくシナプスタンパク質組成の小さな変化を学習した後に発生することが予想され、ラベルフリーのアプローチは、訓練を受けたから得られた対応するタンパク質試料と未処理マウスを比較することが適切であろう。また、安定同位体( 例えば TMT、のiTRAQ、ICPLとSILAC)と同様にMS2ベースのラベルフリーの資格を使用して、タンパク質/ペプチドの条件-特定のラベル戦略ntification(SWATH)は有用であるが、彼らが選択したラベルフリーのアプローチよりも高価であるか、特別な質量分析のハードウェアを必要としています。
プロテオミクス上映は、多くの場合、複雑なデータセットを得ているため、バイオインフォマティクス処理が適切なデータ解釈のために推奨されます。追加のメタアナリシスは、パラダイムに関連した変化と関係する主要な細胞プロセスおよびシグナル伝達経路の特定の根底にある潜在的な分子メカニズムのより良い理解をサポートすることができます。適切な方法は、以下に記載されています。
研究では、マウスの異なる脳領域における学習と記憶の統合時のシナプスタンパク質の発現の変化の正確な定量的プロファイリングのために最適化された方法論的なワークフローを提供します。セットアップは、質量分析用の試料につき少なくとも3つの技術の反復の必要なアプリケーションのにもかかわらず、単一の動物のレベルでのタンパク質発現を研究する機会を提供します。
方法論は、アカウントに高分子量の足場タンパク質からなる前およびpostsynapseの特定のタンパク質組成を取るだけでなく、媒体や低い分子量をもつ重要なメディエーター蛋白質の。シナプトソーム調製物の溶液内消化物は、効率的な世代になると、それゆえ、足場由来ペプチドの過剰表現。これは、順番に、より小さなまたはより低い豊富なタンパク質の解析を抑制することができます。からSDS-PAGE画分の推奨調製並行してゲル内消化手順と組み合わせて、各試料のアリコートは、中、低存在量タンパク質の分析を容易にし、強くお勧め補完的な方法を表しています。試料由来の全ての画分の別個の質量分析適用後( 例えば 、溶液内消化、ゲル内消化、合成リンに富む画分)に対応するMS / MSデータセットは、PEAKSで合成し、タンパク質同定および定量するためのさらなる計算することができます。ソフトウェアまたは代替の一般的なソフトウェアパッケージ。
また、溶液内消化されたサンプルの生成、ゲル内消化由来試料の分画(サンプルレーンの別々に処理ゲルエリア)、画分の個々のアプリケーションを増加させることができる質量分析(イオン交換クロマトグラフィーによって)分析の深さ。しかしながら、この拡張ワークフローは劇的にLS-MS / MSデータ取得に必要な時間を増加させます。 GENERATIOのためプロテオームプロファイリングの指定された時間のコースを学習し、記憶形成時のシナプスタンパク質の再編成の詳細な分子配列のNが必要です。この時間経過は直後に、あるいは最初のトレーニングセッション中に開始し、動物のパフォーマンスは約後学習曲線の漸近レベルに達するまでクローズ噛み合っ時間枠をカバーすることができます。 8 -訓練の10日間(詳細は図2を参照)。
シナプスのタンパク質のリン酸化の変化の分析は、FMTD学習時に選択した時間枠に特に焦点を当てが必要です。一方で、タンパク質のリン酸化と脱リン酸化によってトリガーされることが知られているシナプスタンパク質の再編成を開始するシグナル伝達カスケードは、動物の訓練の非常に初期の段階で期待されています。一方、S内の接続およびアセンブリを調節呼ばれる複数のリン酸化されたシナプスのタンパク質の長期的な修正がありますynapticアーキテクチャ19、20。これらの翻訳後修飾があっても、メモリの統合の後の時点で予想されています。
このプロテオミクスワークフローによって生成された複雑なデータセットは、分子経路と重要な分子を、参加識別するために、バイオインフォマティクスの処理を必要とします。メタアナリシスは、学習と記憶のプロセスにおいて役割を果たしている重要な過剰出現経路を示しています。
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |