The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
Læring er basert på dannelsen av minne spor og vedlikehold. Det er allment akseptert at en underliggende mekanisme kan representere en aktivitet avhengig dannelsen av nye og / eller omorganisering av eksisterende synaptiske kontakter mellom nerveceller. På molekylært nivå, har ulike protein modifikasjoner, subcellulære relocalizations og endringer i omsetningen av synaptiske proteiner blitt beskrevet 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). Men de fleste studiene hittil fokusert på utvalgte proteiner i stedet for på det globale men komplekset synaptisk proteome sammensetning. Den nåværende tilnærmingen gir en upartisk screening for synaptiske proteomet endringer i mus hjernen etter et læringseksperiment. Det er egnet til å gjengi tid punktavhengige molekylære øyeblikksbilder av lærings-indusert omorganisering av den synaptiske arkitektur. Den beskrives arbeidsflyten krever en bestemt teamarbeid av ulike spesialister i dyrs atferd, protein biokjemi, massespektrometri og Biolnformatics.
Den valgte læring paradigme, dvs. frekvens-modulert tone diskriminering (FMTD), er en godt karakterisert auditiv diskriminering oppgave hos gnagere 5. Læring og langsiktige minne formasjon i denne shuttle boksen Go / No-Go-oppgave innebærer mekanismer avhengig av økt cortical dopamin signalering og proteinsyntesen. Følgelig siste proteomikk studier på ørkenrotte og mus viste dopamine- og lærings-indusert plast rearrangements av synaptiske komponenter i hjernebarken, men også i mer basale hjerneområder som visstnok samhandler under FMTD læring og hukommelse 6-8. Dette illustrerer at hukommelsen dannelse involverer et komplekst samspill av forskjellige områder av hjernen og således kan bli differensielt regulert innenfor disse områdene på proteome nivå. Derfor er disseksjon av utvalgte kortikale og subkortikale mus hjernen regioner inngår i arbeidsflyten.
Videre er pålitelig characterizatipå selv svake forandringer i synaptiske proteinsammensetning krever en berikelse av pre- og postsynaptisk kamrene i stedet for analyse av homogenater eller rå membranfraksjoner 9. Derfor er fremstillingen av synaptosomer utnytte etablerte protokoller før proteomikk analyse er beskrevet for å øke deteksjonsnivå, og det dynamiske området for synapse-spesifikke proteiner 10,11.
En viktig forutsetning for å bruke label-free høyoppløselig massespektrometri for kvantitative formål er en høy grad av likhet i proteinprøver. Som heller mindre endringer i synaptiske proteinsammensetning forventes å oppstå etter å lære, vil en etikett-fri tilnærming være hensiktsmessig å sammenligne tilsvarende proteinprøver hentet fra trente og naive mus. Alternativt, tilstandsspesifikke label strategier for proteiner / peptider ved hjelp av stabile isotoper (f.eks TMT, iTRAQ, ICPL og SILAC) samt MS2-baserte label gratis quantification (SWATH) er nyttige, men de er dyrere enn den valgte etikett fri tilnærming eller trenger spesiell massespektrometrisk maskinvare.
Siden proteomikk screenings ofte gir komplekse datasett, er bioinformatiske behandling anbefales for riktig tolking. Andre meta-analyser kan støtte en bedre forståelse av potensielle molekylære mekanismene bak paradigmet relaterte endringer og identifisering av involverte viktige cellulære prosesser og signalveier. Egnede metoder er også beskrevet nedenfor.
Studien presenterer en metodisk arbeidsflyt optimalisert for en nøyaktig kvantitativ profilering av synaptiske protein expression endringer i læring og hukommelse konsolidering i ulike områder av hjernen til mus. Oppsettet gir anledning til å studere protein uttrykk på nivå med et enkelt dyr til tross for det aktuelle programmet på minst tre tekniske replikater per prøve for massespektrometrisk analyse.
Metodikken som tar hensyn til den spesielle proteinsammensetningen av pre- og postsynapse som består av høy molekylvekt stilla proteiner, men også av viktige mediator proteiner som bærer mellom eller lavere molekylvekter. In-oppløsning oppsummeringer av synaptosomale preparater resultere i en effektiv generasjon og dermed en overrepresentasjon av stillas-avledede peptider. Dette, i sin tur, kan undertrykke analyse av mindre eller lavere tallrike proteiner. Den foreslåtte utarbeidelse av SDS-PAGE-fraksjoner fra enaliquot av hver prøve kombinert med en in-gel fremgangsmåte fordøyelse i parallell forenkler analysen av middels og lav overflod proteiner og representerer et sterkt anbefalt komplementær metode. Etter å ha separate massespektrometrisk anvendelse av alle fraksjoner avledet fra en prøve (for eksempel i-løsning fordøye, i-gel fordøye, kombinerte fosfo-anrikede fraksjoner) de tilsvarende MS / MS-datasettene kan kombineres og videre beregnet for protein identifisering og kvantifisering ved topper programvare eller alternative populære programvarepakker.
Alternativt kan den enkelte anvendelse av in-gel-fordøyelse-avledede fraksjoner av en prøve (separat behandlede gel-områder av en prøve kjørefelt) og fraksjoner som genereres av den i-oppløsning spaltet prøve (for eksempel ved ionebytte-kromatografi) for å massespektrometri kan øke analytisk dybde. Men denne utvidede arbeidsflyten øker dramatisk den nødvendige tid for LS-MS / MS datainnsamling. for genen av en detaljert molekylær sekvens av synaptiske protein rearrangementer i løpet av læring og hukommelse i formasjonen en bestemt tid løpet av proteomikk profilering er nødvendig. Denne gangen kurset kan starte umiddelbart etter eller selv under den første treningsøkten og dekker en tett-masket tidsramme til dyrenes prestasjoner nådd asymptotisk nivå av læringskurve etter ca. 8 – 10 dager med trening (se figur 2 for detaljer).
Analysen av fosforylering endringer av synaptiske proteiner krever et særlig fokus på de valgte tidsrammer under FMTD læring. På den ene siden signalkaskader initiere synaptiske protein rearrangements kjent for å være utløst av protein phosphorylations og dephosphorylations forventes på svært tidlige stadier av dyr trening. På den annen side er det langvarige endringer av flere fosforylerte synaptiske proteiner kjent som regulerer tilkobling og montering innenfor synaptic arkitektur 19, 20. Disse posttranslational modifikasjoner er ventet selv på senere tidspunkter minne konsolidering.
De komplekse datasett som genereres av denne proteomikk arbeidsflyten krever bioinformatiske behandling for å identifisere delta molekylære stier og viktige molekyler. Meta-analysen viser betydelige overrepresentert trasé, som spiller en rolle i læring og hukommelse prosesser.
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |