Steiger-gesteunde transplantatie van eilanden in het epididymale vetpaneel van diabetische muizen
Summary
Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.
Abstract
Isletransplantatie is klinisch bewezen effectief te zijn bij het behandelen van type 1 diabetes. De huidige intrahepatische transplantatiestrategie kan echter acute volledige bloedreacties veroorzaken en resulteren in slechte eilandengroei. Hier rapporteren we een robuuste protocol voor de transplantatie van eilandjes op de extrahepatische transplantatieplaats – het epididymale vetpaneel (EFP) – in een diabetische muismodel. Een protocol om eilandjes te isoleren en te zuiveren bij hoge opbrengsten van C57BL / 6J muizen wordt beschreven, evenals een transplantatiemethode die wordt uitgevoerd door zaaimolen op een gedecellulariseerde steiger (DCS) en implanteren ze op de EFP plaats in syngeneuze C57BL / 6J muizen gesmolten diabetische Door streptozotocine. Het DCS-transplantaat dat 500 eilandjes bevat, reverseerde de hyperglycemische conditie binnen 10 dagen, terwijl de vrije holmen zonder DCS minstens 30 dagen nodig hadden. De normoglykemie werd gedurende maximaal 3 maanden gehandhaafd totdat het transplantaat werd geëxplanteerd. Concluderend verhoogde DCS de engraftment van eilandjes in tHij extrahepatische site van de EFP, die gemakkelijk kan worden opgehaald en mogelijk een reproduceerbaar en nuttig platform biedt voor het onderzoeken van de steigermaterialen, evenals andere transplantatieparameters die nodig zijn voor een succesvolle inplanting van het eiland.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1D) is een auto-immuun endocriene aandoening waarbij ercellen door het immuunsysteem worden geablateerd, waardoor patiënten afhankelijk zijn van de injectie van exogeen insuline gedurende hun hele leven. Het protocol van Edmonton vertegenwoordigt een mijlpaal in klinische studies van eilandtransplantatie; Holen werden door de portale ader ingebracht en op de intrahepatische plaats 1 getransplanteerd. Echter, twee grote obstakels-onvoldoende bronnen van donor eilandjes en slechte eilandengroei-voorkomen het grote succes van de eilandtransplantatie 2 . Meestal moeten er eilandjes van drie cadaverische donoren worden verzameld om de hyperglycemische conditie van één patiënt om te keren; Dit komt door de lage opbrengst van isolatieprocedures van het eiland en het eilandverlies na transplantatie. In het bijzonder, hoewel de na-transplantatie-holmen in zuurstofrijk bloed werden gebad, veroorzaakte het directe contact met bloed vaak de onmiddellijke bloedgemedieerde inflammaTory reaction (IBMIR), die het acute verlies van de eilandjes zou kunnen veroorzaken. Op de lange termijn wordt gedacht dat het geleidelijke verlies van eilandjes bij patiënten de daling van de omzettingssnelheid bij diabetes in de klinische groepen vertoont, die in het eerste jaar 90% zou kunnen bedragen en tot 30% en 10% bij 2 en 5 kunnen dalen Jaar na transplantatie respectievelijk 3 .
Isletransplantatie bij extrahepatische plaatsen is een aantrekkelijke strategie om het directe contact van eilandjes met bloed te verminderen, terwijl de transplantaties beperkt zijn tot meer definieerbare locaties in vergelijking met intrahepatische infusie. In de afgelopen jaren zijn studies uitgevoerd in de niercapsule, oog-, spier-, vetkussens en subcutane ruimtes, waardoor de holen op deze sites kunnen overleven en functioneren om normoglykemie 4 te herstellen. Daarnaast zijn de eilandjes op deze plaatsen retrievable, waardoor het mogelijk is voor biopsie of zelfs voor verdere vervangingsprocedures. Extrahepatic sHet toont daarom een groot potentieel voor klinische transplantatie 5 .
Biomaterialen gebaseerde steigers zijn intensief onderzocht voor celtransplantatie en weefselkunde. Drie-dimensionale (3D) steigers bevatten gewoonlijk poreuze structuren en kunnen dienen als cellulaire templates om ruimtelijke structuur / organisatie van cellen te genereren of als reservoirs om de gecontroleerde afgifte van bioactieve signalen te verschaffen. Steigers zijn ook vervaardigd uit polymere materialen, zoals poly (glycolide-L-lactide) 6 , poly (dimethylsiloxaan) 7 en thermoplastisch poly (urethaan) 8 , om transplantatiehallen in de EFP te verplaatsen. In vergelijking met de directe transplantatie van eilandjes bleek het gebruik van steigers het verlies van het eiland te verminderen door het voorkomen van lekkage van eilandjes in de intraperitoneale holte 9 , 10 , die mechanische bescherming en moduWaardoor de lokale ontstekingsreactie plaatsvindt. De steigers kunnen aldus worden ontwikkeld om de inplanting van het eiland op de transplantatieplaatsen 7 te bevorderen .
In deze studie willen we een paradigma van eilandtransplantatie in de EFP tonen, uitgevoerd in muizenmodellen met behulp van een DCS. Steigers die afkomstig zijn van extracellulaire matrices hebben de afgelopen jaren veel interesse aangetrokken door de superieure biocompatibiliteit en meer natuurlijke poreuze structuren in vergelijking met synthetische producten. Hier beschrijven we een robuuste isolatieprotocol om pancreatische holmen bij hoge opbrengsten van C57BL / 6J muizen te verkrijgen. DCS's die van het boviene pericardium werden verwerkt werden vervolgens met holen geplant, en de transplantaten werden geëxplanteerd naar het EFP in syngeneuze diabetische modellen. Normoglykemie in muizen werd binnen 10 dagen bereikt en werd gedurende maximaal 100 dagen bewaard tot de verwijdering van de transplantaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pancreas perfusie en spijsverteringstijd zijn twee belangrijke parameters die de opbrengst en kwaliteit van het eiland beïnvloeden. Moskalewski meldde voor het eerst het gebruik van een ruw collageenmengsel om gesneden marsvinpancreas 11 te verteren. Lacy et al. Meldde de injectie van enzymen in het buisstelsel om de pancreas te perfectioneren, wat de opbrengst van het eiland aanzienlijk verhoogde 12 . De ductale perfusie van het enzym zorgt voor maximale blootst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Wei Zhang van Guanhao Biotech bedanken voor het leveren van de decellularized steigers. We bedanken Xiao-hong Peng voor de goede discussies. Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Project No.31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
