मधुमेह चूहों की एपिडीडिमल फैट पैड में आईलेट्स का स्कैफोल्ड-समर्थित प्रत्यारोपण
Summary
यह प्रोटोकॉल मरीन आइलेट अलगाव को दर्शाता है और एक डिकेलरीकृत स्कैफोल्ड पर सीडिंग करता है। स्कैफोल्ड-समर्थित आइलेट्स को स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन (एसटीजेड) से प्रेरित मधुमेह चूहों के एपिडिडीमल वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया था। आइलेट्स ट्रांसप्लांटेशन साइट पर बचे और हाइपरग्लेसेमिक हालत को उलट कर दिया।
Abstract
आइलेट प्रत्यारोपण प्रकार 1 मधुमेह के इलाज में प्रभावी साबित हुआ है। हालांकि, वर्तमान इंट्राहेपेटिक प्रत्यारोपण रणनीति में अत्यधिक संपूर्ण रक्त प्रतिक्रियाएं आ सकती हैं और नतीजे खराब आइलेट इंग्रीमेंटमेंट में हो सकते हैं। यहां, हम असाध्य प्रत्यारोपण स्थल पर आइलेट के प्रत्यारोपण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं- एपिडिडीमल वेट पैड (ईएफपी) – एक मधुमेह के माउस मॉडल में। सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से उच्च पैदावार में आइसलेट और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, साथ ही एक डिकेलरीकृत पाड़ (डीसीएस) पर सीडिंग आइलेट के द्वारा प्रत्यारोपण विधि के रूप में किया गया है और उन्हें सिनेजेनिक सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में ईएफपी साइट पर प्रत्यारोपित मधुमेह स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन द्वारा 500 ईस्टलेट वाले डीसीएस ग्राफ्ट को 10 दिनों के भीतर हाइपरग्लैलेसिमिक स्थिति को उलट कर दिया गया था, जबकि डीसीएस के बिना मुफ्त islets को कम से कम 30 दिनों की आवश्यकता थी। भ्रष्टाचार का विश्लेषण किए जाने तक मानमोलाइसीमिया को 3 माह तक बनाए रखा गया था। निष्कर्ष में, डीसीएस ने टी के इग्रेटमेंट को टी में बढ़ा दियावह ईएफपी की ऊर्ध्वाधर साइट है, जिसे आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और मचान सामग्री की जांच के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगी मंच प्रदान कर सकता है, साथ ही साथ एक सफल आइलेट engraftment के लिए आवश्यक अन्य प्रत्यारोपण मापदंडों।
Introduction
टाइप 1 डायबिटीज मेलेिटस (टी 1 डी) एक ऑटोइम्यून एंडोक्राइन डिसऑर्डर है जिसमें आइलेट कोशिकाओं को प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा पृथक किया जाता है, जो रोगियों को अपने पूरे जीवन के लिए बहिर्जात इंसुलिन के इंजेक्शन पर निर्भर करता है। एडमोंटन प्रोटोकॉल आईलेट प्रत्यारोपण के नैदानिक अध्ययनों में एक मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करता है; आइलेटों को पोर्टल शिरा के माध्यम से सम्मिलित किया गया था और इंटरेहेपेटिक साइट 1 पर ट्रांसप्लांट किया गया था। हालांकि, दो मुख्य बाधाएं- दाता islets के अपर्याप्त स्रोत और गरीब आइलेट engraftment- आइलेट प्रत्यारोपण 2 की व्यापक सफलता को रोकने। आमतौर पर, एक मरीज की हाइपरग्लिलेसिमिक स्थिति को बदलने के लिए तीन शवदायिक दाताओं से आइसलेट को इकट्ठा करने की आवश्यकता होती है; यह आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं की कम उपज और प्रत्यारोपण के बाद आइलेट का नुकसान होने के कारण है। विशेष रूप से, हालांकि प्रत्यारोपण के बाद के ऑक्सीजनों को ऑक्सीजन युक्त रक्त में नहाया गया था, खून के साथ सीधे संपर्क में अक्सर तत्काल खून-मध्यस्थता में सूजन पैदा होती थीटॉररी रिएक्शन (आईबीआईआईआर), जिसके कारण आइलेट्स का तीव्र नुकसान हो सकता है। लंबे समय में, यह माना जाता है कि रोगियों में आइलेटों का क्रमिक नुकसान नैदानिक समूहों में मधुमेह उत्क्रमण दर की गिरावट के हिसाब से होता है, जो पहले वर्ष में 90% तक पहुंच सकता था और 2 और 5 तक 30% और 10% की गिरावट आई साल के बाद ट्रांसप्लांटेशन, क्रमशः 3
अतिसार स्थलों पर आइलेट प्रत्यारोपण एक आकर्षक रणनीति रही है जो रक्त के साथ आइसलेट के सीधे संपर्क को कम करने के लिए किया जाता है जबकि ट्रांस्प्लांट्स को अंतराहिक आशय के मुकाबले अधिक निश्चित स्थानों पर रखा जाता है। पिछले कुछ वर्षों में गुर्दा कैप्सूल, आंख, मांसपेशियों, वसा पैड, और चमड़े के नीचे के स्थानों में अध्ययन किया गया है, यह दर्शाते हुए कि इन साइटों पर आइटेल्स जीवित रहने में सक्षम है और सामान्य तौर पर मानोगेलेसीमिया 4 को बहाल कर रहा है। इसके अलावा, इन साइटों पर आइलेट्स पुनः प्राप्त करने योग्य हैं, जिससे बायोप्सी या फिर प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के लिए संभव है। एक्स्ट्राहेपेटिक एसइसलिए यह चिकित्सीय प्रत्यारोपण 5 के लिए महान क्षमता का प्रदर्शन करती है।
सेल प्रत्यारोपण और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए जैव सामग्री-आधारित स्कॉफल्ड को तीव्रता से जांच की गई है। थ्री-आयामी (3 डी) स्कॉफल्ड में आमतौर पर झरझरा संरचनाएं होती हैं और सेल्युलर टेम्प्लेट के रूप में सेवा प्रदान कर सकती हैं ताकि स्थानिक संरचना / कोशिकाओं का निर्माण हो या जलाशयों के रूप में बायोएक्टिव संकेतों को नियंत्रित किया जा सके। ईफपी में टोपटाइल इस्टेट्स के लिए, स्कॉफॉल्ड्स को पोलीमरिक सामग्रियों से बना दिया गया है, जैसे पाली (ग्लाइकोलाइड-एल-लैक्टिड) 6 , पॉली (डायमिथाइलसिलोक्सैन) 7 और थर्माप्लास्टिक पॉली (urethane) 8 । आइलेटों के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण की तुलना में, स्कॉफॉल्ड्स का उपयोग इन्टेरेटेिटोनियल गुहा 9 , 10 में आईटालेटों के रिसाव को रोकने के द्वारा आइलेट नुकसान को कम करने के लिए पाया गया, जिसमें यांत्रिक संरक्षण और माउडस्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया लैटिंग प्रत्यारोपण साइटों 7 पर आइलेट engraftment को बढ़ावा देने के लिए स्कॉल्फोल्ड इस प्रकार विकसित किए जा सकते हैं।
इस अध्ययन में, हम ईएफपी में आइलेट प्रत्यारोपण के एक प्रतिमान का प्रदर्शन करना चाहते हैं, जो डीसीएस का इस्तेमाल करते हुए चूहों के मॉडल में किया जाता है। सिंथेटिक उत्पादों की तुलना में बेहतर बायोकोपेटेबिलबिलिटी और अधिक प्राकृतिक झरझरा संरचनाओं के कारण हाल के वर्षों में बाह्य मैट्रिक्स से प्राप्त स्कॉफल्ड ने बहुत रुचि दिखाई है। यहां, हम सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से उच्च पैदावार में अग्नाशयी आइसलेट प्राप्त करने के लिए एक मजबूत अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। गोजाइन पेरीकार्डियम से संसाधित डीसीएस को तब आइलेट्स के साथ बीजगणित किया गया, और ग्रंथों को एसईजीएनिक मधुमेह के मॉडल में ईएफपी में ट्रांसप्लांट किया गया। चूहों में नॉर्मोग्लाइसीमिया 10 दिनों के भीतर प्राप्त किया गया था और गिफ्ट को हटाने तक, 100 दिनों तक बनाए रखा गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
अग्नाशय छिड़काव और पाचन समय दो मुख्य पैरामीटर हैं जो आइलेट उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं। मोस्केलवेस्की ने पहली बार एक कच्चे कोलेजनज मिश्रण का उपयोग कीमा बनाया हुआ गिनी पिग अग्न्याशय 11</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों decanularized scaffolds प्रदान करने के लिए Guanhao बायोटेक से वेई झांग शुक्रिया अदा करना चाहेंगे। उपयोगी चर्चाओं के लिए हम जिओ-हांग पेंग का धन्यवाद करते हैं यह शोध आर्थिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (परियोजना सं .3322021) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
