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Biochemistry

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55001
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1UMR8576, CNRS,Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS,Lille University

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

21 세기 의료의 주요 과제 중 하나는 알츠하이머 병 (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환이다. 타우 미세 소관 (MT)의 형성을 자극 미세 소관 – 연관된 단백질이다. 타우 동등하게, 여러 가지 신경 퇴행성 질환에서 가장 잘 알려진이 AD로되어있는 소위 퇴행성 신경을 참여하고있다. 이러한 질환에서, 타우 쌍 나선형 필라멘트 (PHFs)에서 자기 집합체와는 같은 인산화 1과 번역 후 수정 (PTMS)에 의해 많은 잔류에 수정 발견된다. 타우 단백질의 인산화는 MT 안정화 및 AD 신경 세포의 특징 기능의 병리학 적 손실의 생리 기능을 모두 조절에 관여한다.

질병 뉴런 PHFs에 통합 될 때 더욱이, 타우 단백질은 언제나 2 hyperphosphorylated된다. 2 ~ 3 인산염 그룹을 포함하는 일반 타우는 달리, PHFs에서 hyperphosphorylated 타우 5-9 phosphat을 포함전자 그룹 3. 타우의 과인산 일부 사이트에서와 인산화의 병적 인 사이트라고 추가 사이트의 인산화에 화학 양론의 증가에 모두 해당한다. 그러나, 중복 레벨 4의 양적 차이에도 불구하고, AD 및 인산화의 정상 성인의 패턴 사이에 존재합니다. 어떻게 특정 인산화 이벤트에 영향을 미치는 기능과 타우의 기능 부전은 크게 알려지지 않은 남아있다. 우리는 분자 수준에서 PTMS에 의해 타우 규제를 해독하는 것을 목표로하고 있습니다.

타우의 분자 측면의 이해를 깊게하기 위해, 우리는 기술적 인 문제를 해결해야합니다. 첫째, 타우 솔루션에 고립 본질적으로 무질서 단백질 (IDP)입니다. 이러한 단백질은 생리 학적 조건에서 잘 정의 된 세 가지 차원 구조를 결여하고 그 기능 (들) 및 구조적 특성을 연구하기 위해 특정 생물 물리학 적 방법이 필요합니다. 타우는 실향민의 성장 클래스에 대한 패러다임, 자주와 관련된 발견이러한 신경 퇴행성 질환과 같은 병리, 따라서 그 기능의 기초가되는 분자 파라미터를 이해하기 위해 관심을 증가시킨다. 둘째, 타우 인산화 특성은 최장 441 아미노산 타우 이성체의 순서에 따라 80 전위 인산화 부위와 분석 도전이다. 항체의 다수의 타우 인산화 에피토프에 대해 개발되어 뉴런 또는 뇌 조직 병리학 타우 검출을 위해 사용된다. 인산화 이벤트는 프롤린이 풍부한 지역 내 가까이에 그들의 대부분, 프롤린 지시 키나제의 대상이 적어도 20 사이트에 일어날 수있다. 정 성적 (어떤 사이트?) 및 (화학량 무엇?) 정량적 특성은 가장 최근에 MS 기술 (5)에 의해 곤란하다.

NMR 스펙트럼은 매우 이형태 앙상블 구성 동적 시스템이다 무질서 단백질을 연구하는데 사용될 수있다. 고해상도 NMR 분광법 어플리이었다에드는 타우 단백질의 양 구조와 기능을 조사합니다. 8 – 또한, 타우의 인산화 프로파일의 복잡도 인산화 부위 (6)의 식별을위한 NMR을 이용하여 분자 도구 새로운 분석법의 개발을 이끌었다. 분석 방법으로 NMR은 인산 결합의 정도의 글로벌 방식으로 타우 인산화 사이트의 식별, 하나의 실험에서 모든 단일 사이트 수정의 시각화 및 정량화 수 있습니다. 타우 인산화 과정은 문헌에 풍부하지만, 이들 대부분은 인산화 프로필 불확실성의 큰 정도 따라서 개별 인산화 이벤트의 실제 영향을 떠나는 항체 수행 되었기 때문에이 점은 중요하다. PKA, 글리코겐 신타 제 키나제 3β (GSK3β), 사이클린 의존 키나제 2 / 사이클린 A (CDK2 / CycA에 의해서), 사이클린 의존 키나제 5 (CDK5) / P25의 행위를 포함하는 재조합 키나제향해 타우 인산화 활성을 나타내는 ivator 단백질 세포 외 신호 조절 키나아제 2 (ERK2) 및 미세 소관 연관 조절 키나아제 (MARK)는, 활성 형태로 제조 될 수있다. 또한, 잘 특성화 인산화 패턴 특정 타우 단백질 이소 형을 생성 할 수 타우 돌연변이 타우의 인산화 코드를 해독하는데 사용된다. 8 – NMR 분광법이어서 효소 변성 타우 샘플 6을 특성화하기 위해 사용된다. 타우 인산화 시험관은 글루탐산 (Glu가) 잔기로 선택 빼앗아 /의 Thr 돌연변이 등에 의해 의사 인산화보다 더 도전이지만,이 방식은 장점을 갖는다. 실제로, 인산화도 구조에 미치는 영향도 상호 작용 매개 변수는 항상 글루타민산 산으로 모방 할 수있다. 예 글루 돌연변이 9 재현되지 포스 포세린 (202) (pSer202)의 주위에 관찰 턴 모티브 / phosphothreonine 205 (pThr205)입니다.

<p claSS = "jove_content은"> 여기, NMR 연구를위한 동위 원소 표지 타우의 준비는 설명한다. ERK2에 의해 인산화 타우 단백질 인산화의 병적 인 사이트로 설명 다수의 사이트에 수정, 따라서 hyperphosphorylated 타우의 흥미로운 모델을 나타내고있다. 재조합 ERK2 키나아제에 의해 체외 인산화 타우의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 12 – ERK2은 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / ERK 키나제 (MEK) (10)에 의해 인산화에 의해 활성화된다. 개질 된, 동위 원소로 표지 된 타우 단백질의 제조뿐만 아니라, PTMS의 식별을 위해 사용 된 NMR 전략을 설명한다.

Protocol

15 N 1. 생산, 13 C-타우 (그림 1) BL21에 pET15b-타우 재조합 T7 발현 플라스미드 (13, 14)을 변환 (DE3) 유능한 대장균 박테리아 세포 15. 주 : 최장 (441 아미노산 잔기) 타우 이성체에 대한 cDNA의 코딩은 플라스미드 pET15b에서을 NcoI 및 XhoI에 제한 부위 사이에 클로닝한다. 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라…

Representative Results

도 3a는 용출 구배 중 관찰 된 280 nm에서 큰 흡수 피크를 나타낸다. 크로마토 그램 상기 아크릴 아마이드 겔에서 볼 때이 피크는 정제 된 타우 단백질에 해당한다. 도 3b는 단백질의 탈염이 효율적으로 보장, 280 nm의 전도도의 피크에서 잘 분리 흡수 피크를 보여줍니다. 도 4는 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 여러 단백질 인산화 (16)의 특성을 관찰 겔 – 시프트 (비교 레인 2 …

Discussion

우리는 효소 변성 타우 샘플의 특성을 NMR 분광 분석을 사용 하였다. 재조합 발현과 전장 사람 타우 단백질 여기 기재된 정제 마찬가지로 돌연변이 또는 타우 타우 도메인을 생성하는데 사용될 수있다. 동위 원소 적으로 농축 된 단백질의 재조합 발현을 필요로, NMR 분광법 필요하다. 인산화 사이트의 식별 공명 할당 및 15 N, 13 C 이중 표지 단백질을 필요로한다. 동위 원소의 가격을 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4°C
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software
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References

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).
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