Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner
Summary
We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.
Abstract
Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.
Introduction
En av de största utmaningarna för hälso- och sjukvård i det 21: a århundradet är neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom (AD). Tau är en mikrotubuli-associerat protein som stimulerar mikrotubulus (MT) bildning. Tau är lika involverad i flera neurodegenerativa sjukdomar, så kallade tauopatier, varav den mest kända är AD. I dessa sjukdomar, är Tau själv aggregat i parade spiralfilament (PHF) och fann modifierad på många rester av posttranslationella modifieringar (PTMs) såsom fosforylering 1. Fosforylering av tau-protein är inblandad i både reglering av dess fysiologiska funktion av MT stabilisering och patologisk förlust av funktion som kännetecknar AD neuroner.
Dessutom Tau protein, när den integreras i PHF i sjuka neuroner är alltid hyperfosforylerat 2. Till skillnad från normal Tau som innehåller 2-3 fosfatgrupper, det hyperfosforylerade Tau i PHF innehåller 5-9 Phosphate grupper 3. Hyperfosforylering av Tau motsvarar både en ökning med stökiometri på vissa platser och fosforylering av ytterligare platser som kallas patologiska ställen för fosforylering. Det finns dock överlappningen mellan AD och normala vuxna mönster fosforylering, trots kvantitativa skillnader i nivån 4. Hur specifik fosforylering händelser påverkar funktion och dysfunktion i Tau är i stort sett okända. Vi strävar efter att dechiffrera Tau reglering av PTMs på molekylär nivå.
Att fördjupa förståelsen för de molekylära aspekterna av Tau, måste vi ta itu tekniska utmaningar. För det första är Tau en egen oordnad protein (IDP) när isolerades i lösning. Sådana proteiner saknar väldefinierade tredimensionella strukturen under fysiologiska förhållanden och kräver särskilda biofysikaliska metoder för att studera deras funktion (er) och strukturella egenskaper. Tau är ett paradigm för den växande klassen av internflyktingar, som ofta förekommer i samband medpatologier såsom neurodegenerativa sjukdomar, därmed öka intresset för att förstå de molekylära parametrar som ligger bakom deras funktioner. För det andra är karakteriseringen av Tau fosforylering ett analytiskt utmaning, med 80 potentiella fosforyleringsställen längs sekvensen för den längsta 441 aminosyra Tau-isoformen. Ett antal antikroppar har utvecklats mot fosforylerade epitoper av Tau och används för detektion av patologiska Tau i nervceller eller hjärnvävnad. Fosforylering händelser kan ske på åtminstone 20 platser som omfattas av prolin-riktade kinaser, de flesta av dem i närheten inom Proline-rik region. Den kvalitativa (vilka webbplatser?) Och kvantitativa (vilken stökiometri?) Karakterisering är svårt även av de senaste MS-tekniker 5.
NMR-spektroskopi kan användas för att undersöka oordnade proteiner som är mycket dynamiska system består av ensembler av konformerer. Högupplöst NMR-spektroskopi var tillämped att undersöka både struktur och funktion av Tau-proteinet. Dessutom komplexiteten i Tau s fosforylering profil ledde till utvecklingen av molekylära verktyg och nya analysmetoder som använder NMR för identifiering av fosforyleringsställen 6 – 8. NMR som en analysmetod möjliggör identifiering av Tau fosforyleringsställen i ett globalt sätt, visualisering av alla single-site ändringar i ett enda experiment, och kvantifiering av graden av fosfat inkorporering. Denna punkt är viktig eftersom även fosforylering studier på Tau överflöd i litteraturen, de flesta av dem har utförts med antikroppar, vilket ger en hög grad av osäkerhet över hela profilen för fosforylering och därmed den verkliga effekterna av enskilda fosforylering händelser. Rekombinanta kinaser inklusive PKA, Glykogen-syntas kinas 3β (GSK3P), cyklin-beroende kinas 2 / cyklin A (CDK2 / CycA), cyklin-beroende kinas 5 (CDK5) / p25 agerarivator protein, extracellulär-signal-reglerat kinas 2 (ERK2) och mikrotubulus-affinitet reglerande kinas (MARK), vilka visar fosforylering aktivitet mot Tau, kan framställas i en aktiv form. Dessutom är Tau-mutanter som möjliggör för generering av specifika Tau proteinisoformer med välkarakteriserade fosforyleringsställen mönster som används för att dechiffrera fosforyleringen koden Tau. NMR-spektroskopi används sedan för att karakterisera enzymatiskt modifierade Tau prover 6 – 8. Även in vitro fosforylering av Tau är mer utmanande än pseudo-fosforylering såsom genom mutation av utvalda Ser / Thr i glutaminsyra (Glu) rester, har denna metod sina förtjänster. I själva verket kan varken strukturella effekter eller interaktion parametrar fosforylering alltid imiteras av glutaminsyra. Ett exempel är tur motiv observeras runt fosfoserin 202 (pSer202) / fosfotreonin 205 (pThr205), som inte återges med Glu mutationer 9.
<p class = "jove_content"> Här kan framställning av isotopmärkt Tau för NMR-undersökningar kommer att beskrivas först. Tau-protein fosforyleras av ERK2 modifieras på många platser som beskrivs som patologiska ställen för fosforylering och därmed utgör en intressant modell för hyperfosforylerat Tau. En detaljerad protokoll Tau in vitro fosforylering av rekombinant ERK2-kinas presenteras. ERK2 aktiveras genom fosforylering av mitogen aktiverat proteinkinas / ERK-kinas (MEK) 10-12. Förutom framställningen av modifierade, isotopinmärkt Tau-protein, är NMR strategi som används för identifiering av PTMs beskrivits.Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har använt NMR-spektroskopi för att karaktärisera enzymatiskt modifierade Tau prover. Den rekombinanta expression och rening beskrivs här för fullängds humant tau-protein kan på liknande sätt användas för att producera mutanta Tau eller Tau-domäner. Isotop behövs berikad protein för NMR-spektroskopi, vilket kräver rekombinant uttryck. Identifiering av fosforyleringsställen kräver resonans uppdrag och en 15 N, 13 C dubbelt märkt protein. Med tanke på kostnaden av isotoper är go…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.
Materials
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20°C |
| BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80°C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100X | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4°C |
| 1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20°C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4°C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80°C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
References
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
- Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
- Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
- Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
- Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
- Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
- Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
- Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
- Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
- Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
- Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
- Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
- Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
- Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
- Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
- Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
- Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
- Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
- Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
- Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
- Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
- Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
- Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
- Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
- Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer’s disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
- Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
- Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
- Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
- Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1’s SH3 domain and Tau’s proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
- Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
- Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
- Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
- Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
- Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
- Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
- Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
- Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
- Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).
