Un metodo per misurare il metabolismo in Ordinati sottopopolazioni di cellule Comunità complessi utilizzando Stable Isotope Tracing
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
organismi superiori contengono comunità complesse di tipi cellulari diversi che collaborano per realizzare le funzioni più complesse. Ad esempio, i tumori contengono non solo le cellule cancerose, ma anche fibroblasti, cellule che costituiscono i vasi sanguigni e cellule immunitarie spesso infiltrati 1; sangue contiene una miscela complessa di decine di sottotipi di cellule immunitarie 2; e anche le linee cellulari in coltura possono consistere di più sottopopolazioni, come il lume e sottotipi basali delle cellule di carcinoma mammario 3. Inoltre, tipi di cellule distinte che coesistono può esibire metabolica "collaborazione". Ad esempio, nel cervello, astrociti sono pensati per convertire il glucosio in lattato, che è poi "alimentato" ai neuroni che ossidano il substrato 4; I linfociti T sono in alcuni contesti dipendenti cellule dendritiche adiacenti come fonte di cisteina 5; e le cellule tumorali possono collaborare con Assofibroblasti ciati nei tumori 6. Per comprendere il comportamento metabolico di tali sistemi, è essenziale per separare e misurare le attività metaboliche dei vari tipi di cellule presenti.
Di gran lunga il metodo più utilizzato per separare tipi cellulari è fluorescenza-attivato cell sorting. Questo metodo è ampiamente applicabile, a condizione che il tipo di cellula o lo stato di interesse possono essere "etichettati" con anticorpi fluorescenti, espressione di proteine fluorescenti ingegnerizzate, o altri coloranti. Una possibilità è quella di tipi inizialmente separati cellule attraverso un cell sorter, ri-cultura dei singoli tipi di cellule ottenute, e quindi eseguire studi sul metabolismo di queste culture 7. Tuttavia, ciò è possibile solo se il tipo di cellula o fenotipo è stabile in condizioni di coltura, e non possono catturare comportamento transitorio come stati del ciclo cellulare, né la cooperazione metabolica in co-coltura. Per tali casi, il metabolismo deve essere misurata direttamente su cosìcellule ari. Questa è una sfida dal momento che la cellula di smistamento procedura sottopone cellule alle sollecitazioni che possono falsare il loro metabolismo 8, e siamo consapevoli di solo pochi studi che prendono questo approccio 9, 10. In particolare, abbiamo trovato che i principali metaboliti come aminoacidi può fuoriuscire dalle cellule tenuti in memoria di cella di smistamento, in modo che le misurazioni dell'abbondanza metabolita assoluto non sono più affidabili 11 (anche se il confronto relativo tra le frazioni ordinate può essere ancora valido).
Per aggirare questi problemi, etichettiamo le cellule con isotopi stabili prima di ordinamento e concentriamo sui MID di metaboliti cellulari, piuttosto che abbondanze di metaboliti. Dal momento che i MID si formano su scale temporali più lunghi, essi dovrebbero essere meno influenzati da esposizione a breve termine a condizioni di ordinamento. Abbiamo quantificare MID utilizzando la spettrometria di massa ad alta risoluzione full-scan, che è abbastanza sensibile per fornire data su centinaia di metaboliti a partire da circa 500.000 cellule ordinati, che richiede circa 30-60 minuti di tempo l'ordinamento delle cellule. Un confronto tra un "finto allineati" controllo (cellule passati attraverso lo strumento sorter cella senza gating alcuna specifica popolazione) ed estrazione metabolita direttamente dal piatto di coltura è fatto per assicurare che le MIDs osservati sono rappresentativi di quelli nella cultura originale. A seconda della scelta di isotopi stabili, varie vie metaboliche possono essere studiate con questo metodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro metodo si basa sul principio che MIDs in metaboliti cellulari riflettono la "storia" delle attività metaboliche di una cella. Questo rende possibile indagare attività metaboliche in sottopopolazione di cellule, come si è verificato nel complesso comunità di cellule, prima della procedura di cell sorting. Al contrario, le aree di picco di metaboliti differiscono notevolmente tra estratti di cellule ordinati e estrazione diretta dal piatto della cultura 11. In parte ciò è …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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