Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
Los organismos superiores contienen comunidades complejas de distintos tipos de células que colaboran para llevar a cabo las funciones más complejas. Por ejemplo, los tumores contienen no sólo las células cancerosas, pero también fibroblastos, células que constituyen los vasos sanguíneos, y la célula inmune a menudo infiltra 1; sangre contiene una mezcla compleja de los subtipos de células inmunes 2 docenas; e incluso líneas de células cultivadas pueden consistir en múltiples subpoblaciones, como el luminal y subtipos basales de las células de cáncer de mama 3. Por otra parte, los tipos de células distintas que coexisten puede exhibir "colaboración" metabólica. Por ejemplo, en el cerebro, se cree que los astrocitos para convertir la glucosa a lactato, que es entonces "alimentado" a las neuronas que oxidan este sustrato 4; Los linfocitos T son en algunos contextos dependientes de células dendríticas adyacentes como fuente de cisteína 5; y las células cancerosas pueden colaborar con Assofibroblastos ciadas en los tumores 6. Para entender el comportamiento metabólico de tales sistemas, es esencial para separar y medir las actividades metabólicas de los diversos tipos de células presentes.
Con mucho, el método más ampliamente utilizado para la separación de tipos de células es la clasificación de células activadas por fluorescencia. Este método es ampliamente aplicable, siempre que el tipo de célula o estado de interés pueden ser "etiquetados" usando anticuerpos fluorescentes, la expresión de proteínas fluorescentes de ingeniería, u otros colorantes. Una opción es tipos de células inicialmente separadas a través de un clasificador de células, volver a la cultura de los tipos de células individuales obtenidas, y a continuación, realizar estudios de metabolismo de estos cultivos 7. Sin embargo, esto sólo es factible si el tipo de célula o fenotipo es estable en las condiciones de cultivo, y no pueden capturar comportamiento transitorio como los estados del ciclo celular, ni la cooperación metabólica en co-cultivos. Para tales casos, el metabolismo se debe medir directamente en lorted células. Este es un reto ya que el procedimiento de clasificación de células somete a las células a las tensiones que pueden distorsionar su metabolismo 8, y somos conscientes de sólo unos pocos estudios que toman este enfoque 9, 10. En particular, hemos encontrado que los principales metabolitos tales como aminoácidos puede gotear de las células mantenidas en un tampón de clasificación de células, por lo que las mediciones de la abundancia metabolito absoluta ya no son fiables 11 (aunque comparación relativa entre las fracciones clasificadas aún puede ser valioso).
Para evitar estos problemas, etiquetamos células con isótopos estables antes de la clasificación, y nos centramos en las MID en los metabolitos celulares, en lugar de las abundancias de metabolitos. Dado que los MID se forman durante periodos de tiempo más largos, deben ser menos afectados por la exposición a corto plazo a las condiciones de clasificación. Se cuantifica utilizando MID-análisis completo de espectrometría de masas de alta resolución, que es lo suficientemente sensible como para proporcionar data en cientos de metabolitos a partir de alrededor de 500.000 células clasificadas, que requieren aproximadamente 30-60 minutos de tiempo de clasificación de células. Una comparación entre un "mock" ordenadas de control (células pasan a través del instrumento clasificador de células sin gating cualquier población específica) y la extracción de metabolito directamente de se hace la placa de cultivo para asegurar que los MIDs observados son representativos de los de la cultura original. Dependiendo de la elección de los trazadores de isótopos estables, diversas vías metabólicas pueden ser estudiadas con este método.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro método se basa en el principio de que los MID de metabolitos celulares reflejan la "historia" de las actividades metabólicas de una célula. Esto hace que sea posible para investigar las actividades metabólicas en subpoblación de células, ya que se produjeron en el complejo comunidad de células, antes del procedimiento de clasificación de células. Por el contrario, áreas de los picos de metabolitos difieren notablemente entre los extractos de células clasificadas y extracción directa de la p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
References
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