Impfen<em> Anopheles gambiae</em> Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen

Summary

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Abstract

Die Stimulation der Immunantwort ist ein übliches Werkzeug in Invertebraten-Studien, die die Wirksamkeit und die Mechanismen der Immunität zu untersuchen. Diese Stimulation basiert auf der Injektion von nicht-pathogene Partikel in Insekten, da die Partikel durch das Immunsystem erkannt werden, und wird die Produktion von Immun Effektoren induzieren. Wir konzentrieren uns hier auf die Stimulation der Melanisierung Reaktion in der Mücke Anopheles gambiae. Die melanization Reaktion führt zur Verkapselung von Fremdpartikeln und Parasiten mit einer dunklen Schicht von Melanin. mit Mikrokapillare Glasröhren Um diese Reaktion zu stimulieren, Mücken sind mit Perlen in der Brusthöhle impft. Dann, nach 24 Stunden werden die Mücken seziert die Perlen zu holen. Der Grad der Melanisierung des Wulstes gemessen Bildanalyse-Software. Beads nicht die pathogene Wirkung von Parasiten haben oder ihre Fähigkeit, die Immunantwort zu entziehen oder zu unterdrücken. Diese Injektionen sind ein Weg, um Measure Immun Wirksamkeit und die Auswirkungen der Immunstimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Fruchtbarkeit oder Langlebigkeit. Es ist nicht genau das gleiche wie direkt Wirt-Parasit-Wechselwirkungen zu studieren, aber es ist ein interessantes Tool, Immunität und seine evolutionäre Ökologie zu studieren.

Introduction

Insekten verlassen sich auf Immunreaktionen , sich gegen Parasiten zu schützen und Krankheitserreger ^{von 1 bis 3} , die ⁴ durch ihre Kutikula oder ihre midgut Epithel verletzen. In Mücken, sind diese Reaktionen wirksam gegen Bakterien ^5, Viren ^6, Filariosen ⁷ und Malariaparasiten ^1,8,9. In Mücken, ein Schlüsselimmunantwort ist die Verkapselung von Fremdpartikeln mit Melanin ^{10. – 12..} Diese Einkapselung kann in der Mitteldarms oder in der Hämolymphe passieren System zirkulierenden ^{10 bis 12.} Diese melanization Antwort ist das Ergebnis der pro-Phenoloxidase ¹⁰ kaskadieren ^{– 12,} und es kann zum Tod der Parasiten oder deren Phagozytose führen. Bei erwachsenen Mücken, wo die Anzahl der Hämozyten Zellen beschränkt ist, ist Melanisierung eine humorale Antwort, wie gegen Plasmodium Parasiten oder Filariosen ^7.In einigen anderen Insekten ist es direkt die hemocytes Zellen, die sich um den Parasiten sammelt sie ⁷ bis melanize. Außerdem ist Melanin auch wichtig für mehrere andere physiologische Prozess , wie die Eierproduktion und Hautwunden ⁷ heilen.

Die Stimulation von Immunantworten wird als Werkzeug benutzt , um studieren Insekten Immunität in mehreren landwirtschaftlichen und öffentlichen Gesundheit Modellsysteme ^{13-18. 16,19 –} Es ist in Anopheles gambiae Mücken, die Hauptvektor von Malaria in Afrika, zu studieren Wirt-Parasit – Interaktionen ¹⁴ verwendet. Diese Techniken basieren auf der Fähigkeit der Insekten – Parasiten mit ihren Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ² zu erkennen. Stechmücken können auch andere Moleküle mit ihren biology wie pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) oder erkennen ihre eigenen geschädigter Zellen durch die Freisetzung von Kollagen und Nukleinsäuren stören detektieren. Die Mücke Immunzelle^{23 –} s wie die Hämocyten werden zur Detektion ²⁰ verwendet. Die wichtigsten Immunsignalwege sind Imd, Toll, JAK / STAT – ²⁴ und Ribonukleinsäure – Interferenz (RNAi) ^25,26. Sowohl Toll und Imd Wege beeinflussen die melanization Reaktion und Interaktion mit der pro-Phenoloxidase Kaskade ^{10 bis 12.}

Das Standardwerkzeug verwendet, um die melanization Antwort stimulieren ist die Impfung einer Mücke mit einer kleinen Perle in die Hämolymphe der Brusthöhle. Der Grad der Melanin – Verkapselung kann dann ¹⁹ gemessen werden , nachdem der Wulst durch die Dissektion der Mücke abruft. In den meisten Studien wurde nur eine Perle pro Mücke injiziert ^15,16,27, aber mehr Perlen Injektion möglich ist, um ¹⁹ die Grenzen der melanization Antwort zu studieren. Diese Kügelchen injiziert unter Verwendung einer Injektionslösung (physiologische Serum) Störung der Moskito Physiologie zu begrenzen unddie Austrocknung der Mücke ^15,16,27. Ein Farbstoff wird zu dieser Lösung gegeben bead Auswahl zu erleichtern. Es ist das gleiche für die Dissektion Lösung verwendet , um den Wulst ^15,16,27 abzurufen.

Der Vorteil von Insekten mit nicht pathogenen Stimuli Inokulieren ist die Fähigkeit, auf die direkte Wirkung auf die Immunantwort zu konzentrieren. Es gibt keine komplizieren Effekte aufgrund von Parasiten Pathogenität ^28, Immunsuppression ^29-31 oder Immunevasion ^31-34. Außerdem werden die Folgen der Stimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Langlebigkeit oder Fruchtbarkeit, ebenfalls untersucht. So Forscher evolutionäre Ökologie studieren können solche Werkzeuge ^2,35,36 erfordern. Zum Beispiel Immunherausgefordert Hummeln haben eine verkürzte Lebensdauer unter Hunger. Ähnliche negative Auswirkungen von Immun Stimulationen und Einsätze haben in verschiedenen Invertebraten Modellen beobachtet, die häufig in einer kurzen ergeber Lebensdauer oder weniger Fortpflanzungserfolg ^13,27,37. Solche Studien können in unterschiedlichen Umgebungen ^2,4,38 durchgeführt werden. Immunität Anregende ist auch für diejenigen von Interesse direkt auf Immunopathologie ^39,40 konzentriert.

Dieses Protokoll basiert auf der Inokulation von Kügelchen mit Moskitos die Melanisierung Antwort zu stimulieren und direkt die Menge an Melanin zu messen. Dies ermöglicht eine quantitative und qualitative Untersuchung der melanization Reaktion in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Solch ein Werkzeug zur Stimulation anderer Immunreaktionen, wie die antibakterielle Reaktion Bakterien verlängert werden ⁴¹ Hitze abgetöteten. Es kann auch in vielen ökologischen Einstellungen durchgeführt werden.

Protocol

1. Kochsalzlösung für die Injektion und Dissection Bereiten Sie die Salzlösung durch Zugabe von NaCl, KCl und CaCl 2 zu destilliertem Wasser 1,3 mM NaCl zu erhalten, 0,5 mM KCl und 0,2 mM CaCl 2 bei pH = 6,8. 1 ml 0,1% Methylgrün Lösung auf 99 ml der Kochsalzlösung die transparenten Kügelchen zu färben. Dies ist die 0,001% Methylgrün "Injektionslösung". Dann werden 5 ml 0,1% Methylgrün Lösung zu 45 ml der Salzlösung. Diese 0,01% Methylgrün &quo…

Representative Results

Stechmücken nicht alle melanize die Perlen in der gleichen Weise, wie einige Perlen weniger mit Melanin bedeckt waren als andere (Abbildung 1). Tatsächlich blieben einige Perlen wegen eines Mangels an melanization blau, während andere völlig dunkel waren (Abbildung 1). Der Melanisierung Wert wurde durch lineare Interpolation auf einen Wert zwischen 0 standardisiert (was zu einem blauen und unmelanized bead entsprach) und 100 (entsprechend einer…

Discussion

Diese Injektionstechnik ist nützlich, um die melanization Reaktion in Mücken zu stimulieren und zu studieren. Zum Beispiel, hier untersuchten wir die Wirkung der Immunstimuli Last.

Der entscheidende Schritt in diesem Verfahren ist, um richtig die Mücke impfen. Jede übermäßige Schäden an den Flugmuskeln oder die Mücke selbst kann die Mücke von der Fütterung zu verhindern oder sie kann vor der Dissektion töten. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, um die Mücken auf Eis lange genug zu…

Materials

Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
Software ImageJ	opensource		Version 1.47f7 or later