Abstract
A estimulação de respostas imunes é uma ferramenta comum em estudos de invertebrados para examinar a eficácia e os mecanismos de imunidade. Esta estimulação é baseado em a injecção de partículas não patogénicas em insectos, como as partículas vão ser detectado pelo sistema imunológico e induzem a produção de efectores imunitários. Nós nos concentramos aqui na estimulação da resposta melanizacao no mosquito Anopheles gambiae. Os resultados de resposta melanizacao no encapsulamento de partículas estranhas e parasitas com uma camada escura de melanina. Para estimular essa resposta, os mosquitos são inoculados com contas na cavidade torácica, utilizando tubos microcapilar de vidro. Então, depois de 24 horas, os mosquitos são dissecados para recuperar as contas. O grau de melanização do grânulo é medida utilizando software de análise de imagem. Grânulos não têm os efeitos patogénicos de parasitas, ou a sua capacidade de evitar ou suprimir a resposta imunitária. Estas injecções são uma forma de measure eficácia imunológico e o impacto da estimulação do sistema imunológico em outros traços da história de vida, tais como fecundidade e longevidade. Ele não é exactamente o mesmo que estudando directamente interacções hospedeiro-parasita, mas é uma ferramenta interessante para o estudo da imunidade e da sua ecologia evolutiva.
Introduction
Insetos dependem de respostas imunes para se proteger contra parasitas e patógenos 1 - 3 que violam através da sua cutícula ou a sua epitélio do intestino médio 4. Em mosquitos, estas respostas são eficientes contra bactérias, vírus 5 6, nematóides filarial 7 e parasitas da malária 1,8,9. Em mosquitos, uma resposta imune chave é a encapsulação de partículas estranhas com melanina 10-12. Este encapsulamento pode ocorrer no intestino ou na hemolinfa sistema de circulação 10 - 12. Esta resposta melanização é o resultado de o pró-fenoloxidase cascata 10 - 12, e que pode conduzir à morte dos parasitas ou a sua fagocitose. Em mosquitos adultos, onde o número de células hemócitos é limitado, melanização é uma resposta humoral, como contra parasitas de Plasmodium ou nemátodos filariais 7.Em alguns outros insetos, é diretamente as células hemócitos que se reúnem em torno do parasita para melanize-los 7. Além disso, a melanina também é essencial para vários outros processos fisiológicos como a produção de ovos e feridas cutícula cura 7.
A estimulação de respostas imunes é usado como uma ferramenta para o estudo da imunidade de insectos em vários sistemas de modelo de saúde pública agrícola e 13 - 18. É utilizado em Anopheles gambiae os mosquitos, o principal vetor de malária na África, para estudar as interações parasita-hospedeiro 14 - 16,19. Estas técnicas baseiam-se na capacidade de insectos para detectar parasitas com os seus receptores de reconhecimento de padrões (PRR) 2. Os mosquitos também pode detectar outras moléculas que interferem com a sua biologia, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), ou detectar suas próprias células danificadas devido à liberação de colágeno e ácidos nucleicos. A célula imune mosquitos tais como os hemócitos são utilizados para a detecção de 20-23. As principais vias de sinalização imunes são IMD, Toll, JAK / STAT 24, e interferência do ácido ribonucleico (RNAi) 25,26. Ambos Toll e vias IMD influenciar a resposta melanizacao e interagir com o pró-fenoloxidase cascata 10-12.
A ferramenta de padrão usado para estimular a resposta melanização é a inoculação de um mosquito com um pequeno rebordo na hemolinfa da cavidade torácica. O grau de encapsulamento melanina pode então ser medida 19 depois de recuperar o cordão através da dissecação do mosquito. Na maioria dos estudos, apenas uma esfera foi injectada por mosquito 15,16,27, mas injectando mais grânulos é possível, a fim de estudar os limites da resposta melanização 19. Estes grânulos são injectados utilizando uma solução para injecção (soro fisiológico), para limitar a perturbação do mosquito e fisiologiaa dessecação do mosquito 15,16,27. Um corante é adicionado a esta solução para facilitar a selecção de grânulo. É o mesmo para a solução de dissecção usado para recuperar o grânulo 15,16,27.
A vantagem de inoculação de insectos com estímulos não patogénico é a capacidade de focar sobre o efeito directo sobre a resposta imune. Não há efeitos que complicam devido ao parasita patogenicidade 28, imunossupressão 29-31, ou a evasão imune 31-34. Além disso, as consequências das estimulações de outras características da história de vida, tais como a longevidade ou fecundidade, pode também ser estudado. Assim, os pesquisadores que estudam ecologia evolutiva pode exigir tais ferramentas 2,35,36. Por exemplo, zangões desafiou-imuno têm uma vida útil encurtada sob fome. efeitos negativos semelhantes de estímulos imunitários e implantações foram observadas em diferentes modelos de invertebrados, resultando muitas vezes num curtoer a vida útil ou o sucesso reprodutivo menos 13,27,37. Tais estudos podem ser realizados em ambientes variados 2,4,38. Estimular a imunidade também é de interesse para aqueles focando diretamente imunopatologia 39,40.
Este protocolo baseia-se na inoculação de grânulos com mosquitos para estimular a resposta melanização e directamente medem a quantidade de melanina. Isso permite estudo quantitativo e qualitativo da resposta melanizacao em diferentes configurações experimentais. Uma tal ferramenta pode ser estendido para a estimulação de outras respostas imunes, tais como a resposta antibacteriana a bactérias 41 aquecer-morto. Ele também pode ser realizado em muitos contextos ecológicos.
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Protocol
1. solução salina por injeção e Dissection
- Preparar a solução salina através da adição de NaCl, KCl, e CaCl 2 de água destilada para obter NaCl 1,3 mM, KCl 0,5 mM, e CaCl 2 0,2 mM, a pH = 6,8.
- Adicionar 1 ml de solução verde 0,1% de metilo a 99 ml da solução de soro fisiológico para colorir as contas transparente. Esta é a "solução injectável" verde metil 0,001%.
- Em seguida, adicionam-se 5 ml de solução a 0,1% verde de metilo a 45 ml de solução salina. Esta "solução de dissecação" verde metil 0,01% é 10 vezes mais concentrada em verde metil para facilitar a coloração das pérolas e sua observação durante a dissecção.
NOTA: Filtro de esterilizar o tampão, se necessário.
2. Preparação Capilar
- Calor-pull tubos microcapilar de vidro para obter uma ponta muito fina ligeiramente maior do que as mais pequenas esferas (φ = 40 mm) 42.
- Aberta e umdjust cada capilar, quebrando a ponta com uma pinça ou serrando a ponta fora.
3. Mosquito Empinar
- Traseira A. gambiae a 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% de umidade relativa, e uma luz 12:12 hr: ciclo escuro. Mantenha as fêmeas adultas e dar-lhes acesso a uma solução de açúcar de 10%.
4. Seleções do grânulo com a Capilar
- Pour 0,009 g de grânulos carregados negativamente (40-120 um de diâmetro) numa placa de Petri 5 centímetros e adicionam-se 5 ml de solução de injecção de 30 minutos de antecedência.
NOTA: O objetivo é permitir que o corante de cor as contas para fazer a seleção talão para a injeção mais fácil. Autoclave as contas, se eles não vêm em um frasco estéril. - Usando um tubo capilar montado em um bolbo de pipeta capilar, seleccionar visualmente o menor grânulo em 0,1 mL da solução salina sob um microscópio binocular.
NOTA: Quando inocular várias esferas simultaneamente, selecione três contas a partir de um volume total de 0,1 mL.
5. Manuseamento Mosquito e inoculação
- Usando um aspirador de insectos, colocar cada mosquito em um tubo de 50 ml.
- Relaxar cada mosquito brevemente, colocando o tubo em gelo triturado (2-5 min).
- Coloque um mosquito em seu lado direito sob o microscópio binocular.
- Sob um microscópio estereoscópico, inocular o mosquito com o capilar por perfuração firmemente através do lado esquerdo da cutícula cavidade torácica e depois injectar o líquido e o talão.
NOTA: Tome cuidado para não danificar os músculos de vôo, segurando o capilar como perpendicularmente ao mosquito possível. - Remover o capilar.
- Utilizando uma pinça entomologia pluma, coloque cada fêmea individualmente em um copo de plástico de 180 ml coberto com um mosquiteiro; dar-lhes acesso a uma solução de açúcar de 10%.
NOTA: É necessário ter cuidado com a solução de açúcar, como o mosquito pode ficar preso em gotas da solução açucarada.
6. MosquitoDissecção e Fotografia Bead
- Verifique se os mosquitos estão vivos 24 horas após a inoculação. Se assim for, verificar a sua condição e manter apenas os mosquitos que são capazes de voar.
- Congelar esses mosquitos a -20 ° C.
NOTA: Eles podem ser mantidos vários dias a meses antes da dissecação, se necessário. - Remover asas dos mosquitos, usando uma pinça sob um microscópio binocular em 32X de ampliação. Fixar as asas em lâminas de vidro com fita adesiva transparente. Anote o código usado para cada mosquito individual.
- Coloque as lâminas de vidro em um scanner e digitalizá-los a 1.200 dpi.
NOTA: Verifique se o código é legível para cada mosquito individual. - Em uma lâmina de microscópio de vidro e na solução de dissecção, utilizar uma pinça para separar o tórax da cabeça e do abdómen.
- Abra o tórax com uma pinça para recuperar as contas.
NOTA: Beads que não se movem para o abdômen, não estão em contacto uns com os outros ea maioria deles flutuar livremente em tele hemolinfa. Tenha cuidado para não quebrar o cordão com a pinça, como um cordão não melanizadas pode ser difícil de encontrar. Espere por 1 a 5 min para grânulos para obter uma cor. - Transferir as contas em uma gota de solução de dissecção em uma lâmina de vidro, antes de tirar a foto.
NOTA: Não há necessidade de lavar as contas. - Usando um microscópio equipado com uma câmera, dê uma imagem digital de cada conta com uma definição de iluminação padrão e aumento de 400X.
NOTA: Não altere a iluminação entre as diferentes imagens para permitir a sua comparação.
7. Análise de Imagem: Bead melanizacao
- Abra o software de análise de imagem. Clique em "Arquivo" e depois em "abrir" para encontrar uma imagem de talão.
- Clique em "analisar". Clique em "medições previstas." Marque a caixa "significa valor de cinza" na janela "Definir medidas".
- Clique no ícone do círculo ferramenta de seleção. Selecione o perímetro talão; permanecem emlado do talão e evitar o halo luminoso em torno dele.
- Clique no menu "analisar". Clique em "medida". Obter o valor médio de cinzentos e o tamanho da área da secção transversal do cordão.
- Para obter o valor melanizacao de cada grânulo, realize a seguinte operação usando uma calculadora ou calculadora software: "256 - valor médio de cinza." A medida melanização é um valor entre 0 e 256, com 0 representando uma imagem totalmente branco.
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Representative Results
Os mosquitos que nem todos melanize os grânulos do mesmo modo, como algumas esferas foram cobertas com menos melanina do que outras (Figura 1). Na verdade, alguns grânulos permaneceu azul devido a uma falta de melanização, ao passo que outros foram completamente escuro (Figura 1). O valor melanização foi padronizado por interpolação linear para um valor entre 0 (o que corresponde a um cordão azul e unmelanized) e 100 (correspondendo a uma esfera escuro e fortemente melanizados) (Figura 2A e 2B). Estes valores indicam o grau de melanização dos grânulos e, assim, a força da resposta imune.
Podemos comparar os grânulos uns aos outros por comparação dos seus valores melanização. A resposta melanizacao geralmente segue uma distribuição de Gauss, que permite análises estatísticas clássicas como ANOVA ou GLM Gaussian.
"FO: manter-together.within-page =" 1 "> Estudou-se a variação da resposta melanização com respeito ao número de grânulos inoculadas simultaneamente em um mosquito O objectivo era obter uma melhor compreensão da variabilidade e limites de. a resposta melanização. o tamanho do grânulo não tem qualquer efeito.O valor médio do grânulo melanização diminuiu 71-50 quando o número de grânulos inoculadas aumentada (F igura 2). Existem alguns limites da resposta melanização em um mosquito, quando o desafio imunitário aumenta. Além disso, a resposta melanização diminuiu para menos do talão em cada melanizados-mosquito, 71-35, durante uma a três grânulos, respectivamente. No entanto, o valor melanização do grânulo mais fortemente melanizados ficado sobre constante. A variabilidade de melanização aumentou com o número de grânulos. O esforço melanizacao não foi uniforme entre todos os grânulos em um determinado mosquito,como um talão foi priorizada em detrimento de outros. Esta técnica de injecção é útil para estudar a variabilidade das respostas imunes em mosquitos.
Figura 1: exemplos imagem de um não-melanizados, um parcialmente melanizados, e um talão altamente melanizados após a dissecação. À esquerda, meio e direita são um talão não melanizadas, um talão parcialmente melanizados, e um talão altamente melanizados, respectivamente.
Figura 2: grânulo melanização como uma função do número de grânulos inoculados. (A) Cada ponto mostra a melanização de uma única pérola (com valores variando de 0 melanização de grânulos não melanizadas a 100 para os fortemente melanizadas) e cada coluna de pontos representa um mosquito indivíduo. cada mosquito foi inoculado com um, dois, três ou grânulos. Os pontos sólidos representam o valor mais alto melanizacao por mosquito, os pontos cruzados representam o valor melanizacao intermediário e os pontos vazios representam o valor mais baixo melanizacao. As linhas a cheio representam a média melanização por tratamento do grânulo, as linhas a tracejado mostram a média da mais alta melanização, e as linhas tracejadas indicam a média da melanização menor. (B) A média e o erro padrão da melanização, a mais alta e a mais baixa melanização melanização por tratamento inoculação grânulo. O preto representa o grânulo melanização médio como uma função do número de contas (com valores variando de 0 melanização de grânulos não melanizadas a 100 para os fortemente melanizadas). O ponto vermelho representa a média da mais alta melanização. O triângulo azul representa a média do menor melanizacao. Os bares são os erros padrão. Modificado de referência 19. </ P>
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Discussion
Esta técnica de injeção é útil para estimular e estudar a resposta melanizacao em mosquitos. Por exemplo, aqui nós estudamos o efeito da carga de estímulos imunológico.
O passo crítico neste procedimento é adequada para inocular o mosquito. Qualquer dano excessivo aos músculos de vôo ou para o próprio mosquito pode impedir que o mosquito da alimentação ou podem matá-lo antes da dissecção. Um segundo passo fundamental é manter os mosquitos no gelo tempo suficiente para derrubá-los sem matá-los. Um pequeno recipiente vai facilitar e acelerar o processo, uma vez que permite um contato mais próximo com o gelo. Finalmente, cuidados especiais são necessários durante a dissecção, como pinças, de outro modo quebrar as esferas. Beads embutidos no tecido mosquito pode levar mais tempo para ser colorido pela solução de dissecção.
O uso de vários tipos de contas (como neutra, positiva ou negativamente carregados contas ou contas de vidro) vai levar a resultados diferentes, como eles may não ser todos melanizados com a mesma intensidade 27,43. Na verdade, em comparação com contas de carga neutra, grânulos carregados negativamente levar a uma maior variabilidade na resposta melanizacao entre mosquitos 27. Os grânulos de vidro, por outro lado, são inertes em mosquitos e não desencadeiam a resposta melanização em todos os 27. grânulos carregados negativamente podem assim ser preferido, mas as comparações entre diferentes contas também pode ser pertinente. No entanto, dependendo do tipo de grânulo, um corante diferente pode ser necessário para as soluções de injecção e de dissecação; por exemplo, cresyl corante violeta deve ser usado em vez de verde metil ao usar contas de vidro 27.
Esta técnica de injecção é invasivo para o mosquito. Mesmo em caso de danos e lesões pode ser minimizado e controlado, ferramentas alternativas pode ser uma opção melhor, dependendo do projeto experimental. É difícil para estimular e medir simultaneamente várias respostas imunitárias no mesmo mosquito. Trabalhoing em famílias ou grupos de mosquitos é necessária quando se olha para as correlações entre as respostas imunes 28. Além disso, os grânulos são apenas parcialmente semelhante ao real presença de parasitas em um inseto.
Em primeiro lugar, a resposta imune é estimulada, e, em seguida, a resposta fenotípica resultante, o encapsulamento, é medido, mas o que acontece no meio é desconhecida. Acoplamento injeções com ferramentas fisiológicas ou moleculares 10 - 12 pode melhorar a nossa compreensão desta resposta melanizacao. Para estudar os mecanismos subjacentes da resposta melanização, a expressão de enzimas-chave ou moléculas produzidas durante a cascata pró-fenoloxidase pode ser medido 10-12. No entanto, concentrando-se unicamente na para cima ou para baixo-regulação de tais moléculas, sem saber as consequências reais do encapsulamento final, pode levar a uma avaliação imprecisa do processo melanizacao. Portanto, enca estudarpsulation e os mecanismos moleculares juntos seria altamente informativos, apesar do facto de serem cada uma técnica científica válida quando utilizados separadamente.
Para concluir, esta é uma técnica para estudar a imunidade e a evolução da imunidade. Há, por exemplo, cada vez mais provas de uma ligação entre a resistência aos inseticidas e susceptibilidade mosquito para parasitas da malária. Esta técnica de injecção pode ser usado num contexto tal, bem como em ensaios de campo. Uma segunda direcção de trabalho seria combinar estimulação imunológica com knockdowns genes para estudar vias imunitárias em detalhe.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
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