inoculating<em> Anopheles gambiae</em> Mygg med perler for å indusere og måle Melanization immunrespons

Summary

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Abstract

Stimulering av immunresponser er et vanlig verktøy i virvelløse studier for å undersøke effekt og mekanismer for immunitet. Denne stimuleringen er basert på injeksjon av ikke-patogene partikler i insekter, slik at partiklene vil bli detektert av immunsystemet og vil indusere produksjonen av immun effektorer. Vi fokuserer her på stimulering av melanization respons i myggen Anopheles gambiae. De melanization respons fører til innkapsling av fremmede partikler og parasitter med en mørk lag av melanin. For å stimulere til dette svaret, er mygg inokulert med perler i brysthulen ved hjelp microcapillary glassrør. Deretter, etter 24 timer, er myggen dissekert for å hente kulene. Graden av melanization av vulsten blir målt ved hjelp av bildeanalyse-programvare. Perler har ikke de patogene virkninger av parasitter, eller deres evne til å unngå eller undertrykke immunresponsen. Disse injeksjoner er en måte å målere immun effekt og virkningen av immunstimuleringer på andre livshistorietrekk, slik som fruktbarhet eller levetid. Det er ikke akkurat det samme som direkte studere vert-parasitt interaksjoner, men det er et interessant verktøy for å studere immunforsvar og dens evolusjonær økologi.

Introduction

Insekter er avhengige av immunresponser for å beskytte seg mot parasitter og patogener ^{1 – 3} som bryter gjennom sin skjellaget eller deres midgut epitel ^4. I mygg, disse svarene er effektiv mot bakterier ^5, virus ^6, filarial nematoder ^7, og malariaparasitter ^1,8,9. I mygg, er en viktig immunrespons innkapsling av fremmede partikler med melanin ^10-12. Denne innkapsling kan skje i midttarmen eller i den hemolymfe sirkulerende system ^{10 – 12.} Dette melanization respons er et resultat av den pro-phenoloxidase cascade ^10-12, og det kan føre til døden av parasitter eller til deres fagocytose. Hos voksne mygg, der antall hemocytes celler er begrenset, er melanization en humoral respons, som mot Plasmodium parasitter eller filarial nematoder ^7.I enkelte andre insekter, er det direkte de hemocytes celler som samles rundt parasitten til melanize dem ^syv. Dessuten er melanin også viktig for flere andre fysiologisk prosess som eggproduksjon og skjel sår healing ^7.

Stimulering av immunresponser blir brukt som et verktøy for å studere insekt immunitet i flere traktorer og offentlig helse modellsystemer ^{for 13 – 18 år.} Den brukes i Anopheles gambiae mygg, den viktigste vektoren av malaria i Afrika, for å studere verts parasitt interaksjoner ^{14 – 16,19.} Disse teknikkene er basert på evnen av insekter for å detektere parasitter med sine mønstergjenkjennings reseptorer (PRR) ^2. Mygg kan også oppdage andre molekyler som forstyrrer deres biologi som patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs), eller oppdage sine egne skadede celler på grunn av utgivelsen av kollagen og nukleinsyrer. Myggen immuncellers slik som hemocytes blir brukt for deteksjon ^20-23. De viktigste immunsignalveier er IMD, Toll, JAK / STAT ^24, og ribonukleinsyre interferens (RNAi) ^25,26. Både Toll og IMD trasé påvirke melanization respons og samhandle med pro-phenoloxidase cascade ^10-12.

Standarden verktøy som brukes til å stimulere melanization responsen er inokulering av en mygg med en liten perle i hemolymph av brysthulen. Graden av melanin innkapsling kan deretter måles ¹⁹ etter henting vulsten ved disseksjon av mygg. I de fleste studiene ble bare en perle injisert per mygg ^15,16,27, men injisere flere perler er mulig for å studere grensene for melanization respons ^19. Disse perlene injiseres ved hjelp av en injeksjonsoppløsning (fysiologisk serum) for å begrense forstyrrelse av mygg og fysiologiuttørking av mygg ^15,16,27. Et fargestoff ble tilsatt til denne løsningen for å lette perle valg. Det er det samme for disseksjon oppløsningen som benyttes til å hente vulsten ^15,16,27.

Fordelen med å inokulere insekter med ikke-patogene stimuli er evnen til å fokusere på den direkte effekt på immunresponsen. Det er ingen kompliserende effekter som skyldes parasitten patogenitet ^28, immunsuppresjon ^29-31, eller immununndragelser ^31-34. Dessuten konsekvensene av stimuleringer på andre livshistorietrekk, for eksempel lang levetid eller fruktbarhet, kan også bli studert. Dermed kan forskerne studere evolusjonær økologi krever slike verktøy ^2,35,36. For eksempel, immuno-utfordret humler har en kortere levetid i henhold til sult. Lignende negative effekter av immunstimulering og distribusjoner har blitt observert i forskjellige virvelløse modeller, som ofte resulterer i en korter levetiden eller mindre reproduktiv suksess ^13,27,37. Slike undersøkelser kan utføres i forskjellige miljøer ^2,4,38. Stimulere immunitet er også av interesse for de som fokuserer direkte på immunpatologi ^39,40.

Denne protokollen er basert på inokulering av perler med mygg å stimulere melanization respons og direkte måler mengden av melanin. Dette gjør det mulig kvantitativ og kvalitativ undersøkelse av melanization responsen i forskjellige eksperimentelle innstillinger. Et slikt verktøy kan utvides til stimulering av andre immunresponser, slik som antibakteriell respons på varme-drepte bakterier ^41. Det kan også bli gjennomført i flere økologiske innstillinger.

Protocol

1. Saline injeksjonsvæske, oppløsning og Dissection Fremstille saltløsning ved tilsetning av NaCl, KCl, og CaCl2 til destillert vann for å oppnå 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl og 0,2 mM CaCl2 ved pH = 6,8. Tilsett 1 ml 0,1% metyl-grønn oppløsning til 99 ml av saltoppløsning for å farge de transparente kuler. Dette er 0,001% metyl-grønn "injeksjonsoppløsning". Deretter tilsett 5 ml 0,1% metyl-grønn løsning til 45 ml saltoppløsning. Dette 0,01% metyl gr…

Representative Results

Mygg ikke alle melanize perlene på samme måte, som enkelte perler ble mindre dekket med melanin enn andre (figur 1). Faktisk noen perler forble blå på grunn av en mangel på melanization, mens andre var helt mørkt (figur 1). Den melanization verdien ble standardisert ved lineær interpolering til en verdi mellom 0 (som tilsvarte en blå og unmelanized vulst) og 100 (svarende til en mørk og tungt melanized vulst) (figur 2a og …

Discussion

Dette injeksjonsteknikk er nyttig for å stimulere og studere melanization respons hos myggen. For eksempel, her studerte vi effekten av immun stimuli belastning.

Den kritiske trinn i denne prosedyren er å riktig vaksinere mygg. Noen overdreven skade på fly muskler eller til mygg i seg selv kan hindre myggen fra fôring eller kanskje drepe den før disseksjon. Et annet viktig skritt er å holde myggen på is lenge nok til å slå dem ut uten å drepe dem. En liten beholder vil lette og fre…

Materials

Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
Software ImageJ	opensource		Version 1.47f7 or later