Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) - und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.
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Methodenartikel
Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit von embryonalen Stammzellen (ESCs) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), verschiedene Zelltypen zu erzeugen, hat neue Wege im Bereich der regenerativen Medizin eröffnet. Trotz ihrer Vorteile war das tumorigene Potenzial von ES-Zellen und iPS-Zellen jedoch lange Zeit ein Hindernis für klinische Anwendungen. Interessanterweise wurde gezeigt, dass ESCs mehrere lösliche Faktoren produzieren, die die Geweberegeneration fördern und die Zellalterung verzögern können, was darauf hindeutet, dass ESCs und iPSCs auch als zellfreie Interventionsmethode eingesetzt werden können. Daher war die Methode zur Gewinnung von embryonalen Stammzellen (mESC)-konditioniertem Medium (mESC-CM) der Maus mit minimaler Kontamination von Serumbestandteilen (fetales Rinderserum, FBS) und Feederzellen (embryonale Fibroblasten der Maus, MEFs) sehr gefragt. Hier demonstriert die vorliegende Studie eine optimierte Methode zur Entnahme von mESC-CM unter serum- und feederfreien Bedingungen und zur Charakterisierung von mESC-CM mittels Seneszenz-assoziierter Mehrfachauslesungen. Dieses Protokoll wird eine Methode zur Erfassung reiner mESC-spezifischer sekretorischer Faktoren ohne Kontamination von Serum und Feeder bieten.
Einleitung
Das Ziel dieses Protokolls ist embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM) von serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen zu sammeln und ihre biologischen Funktionen zu charakterisieren.
Im Allgemeinen haben embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ein großes Potential für die regenerative Medizin und Zelltherapie aufgrund ihrer Pluripotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung 1-3. Jedoch hat die direkte Transplantation von Stammzellen mehrere Einschränkungen, wie Immunabstoßung und Tumorbildung 4,5. Daher kann ein zellfreier Ansatz eine alternative therapeutische Strategie für die regenerative Medizi....
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Protokoll
HINWEIS: Ein Schema des serum- und feeder freien CM Sammelprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Materialien (Herstellung von MEF, Medium, Platten, und Lösungen)
- Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur der MEFs. Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS (ESC-Qualität), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
- Isolieren MEFs von Embryonen nach einer etablierten Routine - Protokoll 13 und halten sie in MEF Medium.
- Bereiten 500 ml Medium der mESCs zur Kultur. DMEM mit 15% FBS und 2 mM L-Glutamin, 100 & mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 100 & mg....
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Ergebnisse
Ursprünglich mESCs sind auf einem MEF Feeder in MESC Medium mit FBS und andere Ergänzungen (1A und 2A) gehalten. CM wurde von mESCs in der verkleinerten Serum Medien ohne Feeder - Schicht, FBS oder andere Ergänzungen (1B und 2B) gesammelt. Diese Kulturbedingungen ermöglicht es uns, MESC spezifische konditionierte Medium ohne eine mögliche Kontamination durch die Faktoren aus dem Einzug, FBS oder andere Ergänzungen zu sam.......
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Diskussion
Für die erfolgreiche Sammlung von Serum- und Feederfreien MESC-CM, sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. Der wichtigste Faktor ist für die Sammlung von MESC-CM frühen Passage mESCs verwenden. Bisher hat es sich gezeigt, dass eine frühe Passage MESC-CM bessere Anti-Aging-Effekte im Vergleich zu späten Passage mESCs hat. Die Passage Anzahl von mESCs wurde berichtet, ihr Entwicklungspotenzial 16 und Pluripotenz 17 zu beeinflussen.
Während weitere For.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) und dem Medical Research Center-Programm (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung. Diese Forschung wird auch von einem Start-up Betriebskostenzuschuss der Hospital for Sick Children (HK Sung) unterstützt. Wir möchten, dass Laura Barwell und Sarah JS Kim für ihre hervorragende Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. Andras Nagy für die Bereitstellung der G4 MESC Linie zu danken.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES-Zellqualität |
| Penicillin und Streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin |
| L-Glutamin | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nichtessentielle Aminosäuren (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 &Mikro; M |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 &Mikro; M |
| Leukämie-Hemmfaktor | Millipore | #ESG1107 | 100 Einheiten/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma | P6148 | 3,70% |
| Dimethylformamid (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Kaliumferricyanid | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| Kaliumferrocyanid | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 &Mikro; g/ml |
| Propidiumiodid | Sigma | #P4170 | 50 &Mikro; g/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse Transkript-Tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR Mastermix | Angewandte Biosysteme | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-der-Fibroblasten | LONZA | #CC-2511 | |
| Flaschenaufsatzfilter | Corning | #430513 | 0.2 μ m |
Referenzen
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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