Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori
Summary
Il protocollo cultura leptomeningi espianto dal post-mortem cervello umano è un modo tecnicamente robusto e semplice da ricavare fibroblasti meningei fibronectina-positivo entro 6-8 settimane e crioconservazione circa 20-30 milioni di cellule.
Abstract
Anche se è stato fatto grandi progressi nella caratterizzazione clinica della malattia di Parkinson, diversi studi riportano che la diagnosi della malattia di Parkinson non è patologicamente confermato fino al 25% della malattia diagnosi clinica di Parkinson. Pertanto, tessuti raccolti da pazienti clinicamente diagnosticata la malattia di Parkinson idiopatica può avere un alto tasso di diagnosi errate; da qui in studi in vitro da tali tessuti per studiare il morbo di Parkinson in un modello preclinico può diventare inutile.
Raccogliendo leptomeningi umani post-mortem con una diagnosi neuropatologica confermata di malattia di Parkinson e caratterizzata da perdita di cellule nigrostriatale e inclusioni proteiche intracellulari chiamati corpi di Lewy, si può essere certi che parkinsonismo clinicamente osservata non è causata da un altro processo patologico di base (ad esempio tumori, arteriosclerosi).
Questo protocollo presents la dissezione e la preparazione di leptomeningi umani post mortem per la derivazione di una cultura di fibroblasti meningea. Questa procedura è robusto e ha un alto tasso di successo. La sfida della cultura è la sterilità come l'approvvigionamento del cervello non è generalmente effettuata in condizioni di sterilità. Pertanto, è importante integrare mezzi di coltura con un cocktail di penicillina, streptomicina, e amfotericina B.
La derivazione dei fibroblasti meningei dai casi autopsia confermati con la malattia di Parkinson fornisce le basi per la modellazione in vitro di malattia di Parkinson. fibroblasti meningei compaiono 3-9 giorni dopo la preparazione del campione e circa 20-30 milioni di cellule possono essere crioconservati in 6-8 settimane. La cultura fibroblasti meningeo omogeneo e le cellule esprimono fibronectina, un marker comunemente usato per identificare meningi.
Introduction
Meningi costituiti da tre membrane che proteggono il cervello: dura madre madre, aracnoide e pia. Più recentemente, è stato riconosciuto che meningi svolgono un ruolo importante nello sviluppo del cervello e del cervello omeostasi 1. Meningi sono derivati da mesenchimali e le cellule derivati dalla cresta neurale ed è interessante notare, è stato dimostrato che le cellule progenitrici residenti nel meningi possono dare origine a neuroni in vitro e dopo il trapianto in vivo 2, 3, 4. Culture meningi sono stati utilizzati con successo anche come strati di alimentazione, in quanto in possesso di cellule derivate da attività Indurre stromale per la differenziazione delle cellule staminali embrionali in neuroni dopaminergici 5. Inoltre, leptomeningi hanno il potenziale di differenziarsi direttamente in neuroni, astrociti, oligodendrociti e in condizioni ischemiche 6.
Per questo protocollo, meningi post-mortem umani campioni sono raccolti presso l'aracnoide e pia, chiamati collettivamente le leptomeningi, e sono acquistati come parte di una donazione cervello umano per scopi di ricerca. La dissezione del cervello viene eseguita entro 24 ore di morte e il campione leptomeningi è collocato in terreni di crescita a freddo per l'ulteriore elaborazione entro il prossimo 6-8 h, come illustrato qui in questo protocollo.
Questo protocollo descrive la dissezione e preparazione dei campioni meningi umani per lo sviluppo della coltura cellulare leptomeningi primarie paziente. Il tessuto viene tagliato in 25-30 pezzi di circa 3 mm x 3 mm quadrati. Tre pezzi sono collocati in ogni 6 pozzetti di gelatina rivestite bene e tenuto premuto con coprioggetto di vetro rotondo. La dissezione meningi dura circa 25-35 minuti. La sfida principale con questa cultura è la sterilità come l'approvvigionamento del cervello, dei trasporti, e la dissezione non sono generalmente eseguite in condizioni sterili. Therefore, è importante integrare mezzi di coltura con un cocktail di penicillina, streptomicina, e amfotericina B e utilizzare piatti multi-pozzetto per separatamente pezzi di tessuto di coltura.
Conseguenza di fibroblasti meningei si verifica di solito entro la prima settimana. Media viene cambiata ogni due o tre giorni fino a quando le cellule sono confluenti e le cellule sono enzimaticamente diversi passaggi. I fibroblasti meningei sono crioconservati a 1 milione di cellule per mL / flacone in mezzi crioconservazione. Con questo protocollo, 20-30 milioni di fibroblasti meningei possono essere derivate in 6-8 settimane per la crioconservazione. applicazioni a valle di questi fibroblasti meningei sono colture primarie per la ricerca sulle malattie, la differenziazione neuronale diretta o derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte dalle leptomeningi per la comprensione dei meccanismi della malattia e per lo sviluppo di farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un protocollo semplice e robusto per derivare una coltura di fibroblasti meningeo da leptomeningi post-mortem umani raccolti in combinazione con una donazione cervello. Ci sono pochissime le descrizioni di protocolli per ricavare colture di cellule dal materiale umano post-mortem. Due studi descrivono la pelle derivati da colture di fibroblasti 7, 8, 9, uno studio descrive campioni Dura <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
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