Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi
Summary
İnsan postmortem beyin leptomeninkslerde eksplant kültür protokolü 6-8 hafta içinde fibronektin pozitif meningeal fibroblastlar elde ve yaklaşık 20-30 mikrogram milyon hücre cryopreserve için teknik sağlam ve basit bir yoludur.
Abstract
Büyük ilerleme Parkinson hastalığının klinik karakterizasyonu yapılmış olsa bile, bazı çalışmalar Parkinson hastalığı tanısı patolojik klinik olarak teşhis Parkinson hastalığı% 25 kadar teyit olmadığını bildirmektedir. Bu nedenle, doku yanlış tanı yüksek oranda olabilir idiyopatik Parkinson hastalığı olan klinik tanısı alan hastaların toplanan; Bir klinik öncesi bir model beyhude olabilir gibi dolayısıyla bu tür dokulardan in vitro çalışmalar Parkinson hastalığı incelemek için.
Parkinson hastalığının bir teyit nöropatolojik tanısı ile postmortem insan leptomeningial toplama ve nigrostriatal hücre kaybı ve Lewy cisimcikleri denilen hücre içi protein kapanım ile karakterize tarafından, bir klinik gözlenen parkinsonizm altta yatan başka bir hastalık süreci (örneğin tümör, damar sertliği) neden olmadığından emin olabilirsiniz.
Bu protokol, miyodiseksiyon ve meningeal fibroblast kültürü türetilmesi için postmortem insan leptomeninks hazırlanması ts. Bu prosedür sağlam ve yüksek bir başarı oranına sahiptir. Beyin tedarik genellikle steril koşullar altında yapılır değil gibi kültürün meydan kısırlık olduğunu. Nedenle, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B bir kokteyli ile kültür ortamı tamamlanması önemlidir
Parkinson hastalığı olan otopsi doğrulanmış vakaların gelen Meningeal fibroblast türetme Parkinson hastalığı in vitro modelleme için temel sağlar. Meningeal fibroblastlar 3-9 gün numune hazırlandıktan sonra ortaya çıkar ve yaklaşık 20-30 milyon hücre 6-8 hafta içinde dondurularak saklanabilir. Meningeal fibroblast kültürü homojen ve hücreler fibronektin, meninksler tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici ifade eder.
Introduction
dura mater, araknoid ve pia mater: zarları beyni korumak üç membranların oluşur. Daha yakın zamanlarda, meninksler da beyin gelişimi ve beyin homeostazında 1 önemli bir rol oynadığı kabul edilmiştir. Zarları mezenşimal ve nöral tepe türetilmiş hücrelerden elde edilir ve ilginç bir şekilde, in vitro ve in vivo, 2, 3, 4 ve transplantasyon sonrası nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir meninks ikamet eden progenitör hücreler gösterilmiştir. Bunlar dopaminerjik nöronlar 5 embriyonik kök hücre farklılaşması için stromal hücre türevli indükleyici aktivite gösterirler zarları kültürleri de başarılı bir şekilde, besleyici tabakalar olarak kullanılmıştır. Ayrıca, leptomeninkslerde doğrudan iskemik koşullarda 6 altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere içine ayırt etme potansiyeline sahiptir.
Bu protokol için, insan postmortem zarları örnekleri topluca, araknoid ve pia mater toplanan leptomeningial denilen ve araştırma amaçlı bir insan beyninin bağışı parçası olarak temin edilir edilir. beyin Diseksiyon ölüm 24 saat içinde gerçekleştirilir, bu protokolde burada gösterildiği gibi leptomeninkslerde Örnek daha sonra 6-8 saat içinde daha fazla işlem için soğuk büyüme ortamı içinde yerleştirilir.
Bu protokol, hastaya primer leptomeninkslerde hücre kültürü gelişimi için diseksiyon ve insan beyin zarı numunelerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Doku, yaklaşık 3 mm x 3 mm kare 25-30 parçalar halinde kesilir. Üç adet her biri 6-kuyu yerleştirilir jelatin kaplı iyi ve yuvarlak cam lamelleri aşağı düzenledi. zarları diseksiyon yaklaşık 25-35 dakika sürer. Bu kültürün ana zorluk beyin tedarik, taşıma ve diseksiyon olarak sterilite genellikle steril koşullar altında yapılır edilmemektedir. Therefore, penisilin, streptomisin, ve amfoterisin B'nin bir kokteyl ile kültür ortamını desteklemek ve ayrı ayrı kültür doku parçaları çok iyi yemekler kullanmak önemlidir.
Meningeal fibroblast akıbet genellikle ilk hafta içinde ortaya çıkar. Hücreler birleştiklerinde kadar Ortam, her iki ya da üç günde bir değiştirilir ve hücreler, enzimatik olarak geçirilir. Meningeal fibroblastlar dondurulması medyada ml / şişe başına 1 Milyon hücre Kriyoprezerve bulunmaktadır. Bu protokol ile, 20-30.000.000 meningeal fibroblastlar dondurulması için 6-8 hafta içinde elde edilebilir. Bu Meningeal fibroblastların Mansap uygulamaları hastalık araştırması, doğrudan nöronal farklılaşma ya da hastalık mekanizmalarının anlaşılması için ve ilaç geliştirme leptomeninks gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin derivasyon için birincil kültürleri vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, beyin bağışı ile birlikte toplanan insan postmortem leptomeninks bir meningeal fibroblast kültürü elde etmek için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır. postmortem insan malzemeden hücre kültürleri elde etmek için protokoller çok az açıklamaları vardır. İki çalışma, Cilt türevli, fibroblast kültürler 7, 8, 9, bir çalışma dura numuneler 10 tarif eder ve bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
