3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔
Summary
이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.
Abstract
여기에서는 시험 관내 폐 세포 배양 여러 컴포넌트 세포 배양 하이드로 겔을 형성하기위한 방법을 제시한다. 돼지, 쥐, 또는 마우스에서 블록의 폐 조직 엔 건강을 시작으로, 조직은 관류 및 세포 파편을 제거하기 위해 후속 화학 세제에 잠겨있다. 처리 전후의 조직 학적 비교는 이중 가닥 DNA 및 알파 갈 락토시다 제 염색을 95 % 이상 제거하는 것을 확인 세포 파편의 대부분이 제거되어 나왔다. 탈세 포화 후, 조직을 동결 건조 후 분말로 cryomilled이다. 매트릭스 분말 산성 펩신 소화 용액에 48 시간 동안 절단 한 후, 프리 겔 용액을 형성하기 위해 중화된다. 프레 겔 용액의 겔화 37 ° C에서 배양하여 유도 할 수 있고, 곧바로 다음 중화 사용 또는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 코팅은 C에 대한 비 처리 판의 프리 겔 용액을 사용하여 형성 될 수있다엘 첨부. 세포는 세포 골격을 통해 이전 또는 코팅에 도금 할 수있는 형성된 겔의 표면 상에 도금 된 3 차원 배양을 달성하기 위해 자기 조립 전에 프레 겔에 현탁 될 수있다. 전략에 변화가 겔화 온도, 강도, 또는 단백질 단편의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다 발표했다. 하이드로 겔 형성 외에도 하이드로 겔 강성 genipin을 사용하여 증가 될 수있다.
Introduction
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
생물학 적분 측면 중 하나는 특정한 작업을 수행하는 계층 적 구조로 분자의 자기 조직이다. 연구실에서 (13)는, 자기 조립은 염 농도, 산도, 소화 기간 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이, 자기 조직화 하이드로 폼 가용화 된 단백질은 생리 학적 온도로 돌아 오면. 형성된 하이드로 겔은 생체 외에서 세포의 부착과 증식을 촉진 할 수있다.
ECM?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그대로 돼지의 폐 조직 기증에 대한 스미스 필드 팜을 감사드립니다. 우리는 또한 우리 자신의 장비를 사용할 수 있도록 박사 후 양 박사 크리스티나 당나라와 VCU 성형 외과 부서에 감사의 말씀을 전합니다. 히드로 겔 및 조직 샘플은 자금 조달 형태 NIH-NCI 암 센터 지원 그랜트에 의해 부분적으로 NIH – NINDS 센터 코어 그랜트 (5) P30 NS047463에서 자금에 의해 부분적으로 지원되는 해부학 및 신경 생물학 현미경 시설의 VCU 부서에서 SEM을 준비했다 P30의 CA016059. VCU 나노 기술 핵심 특성화 시설 (NCC)에서 샘플의 SEM 영상. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation), CMMI 1351162에 의해 투자되었다.
Materials
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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