הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Summary

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Abstract

נויטרופילים הם קריטיים לארח הגנת מולד, וכתוצאה מכך, מהווים תחום חשוב של מחקר רפואי. Phagosome, התא התאי שבו ההרג והעיכול של חלקיקים הציפו להתקיים, הוא הזירה העיקרית הרג הפתוגן נויטרופילים הדורש רגולציה הדוקה. Phagosomal pH הוא היבט אחד כי נשלט בקפידה, בתורו מסדיר פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית. רבים ניאון צבעי pH רגיש שימשו כדי להמחיש את הסביבה phagosomal. יש S-1 מספר יתרונות על פני צבעי pH אחרים רגיש, כוללים ספקטרום הפליטה הכפול שלה, עמידותו-הלבנת תמונה, ואת pKa הגבוהה שלה. באמצעות שיטה זו, אנו הוכחנו כי phagosome נויטרופילים הוא אלקליין חריג בהשוואת פגוציטים אחרים. באמצעות הטיות ביוכימיים שונים של הצבע, phagosome ניתן שמסומן מן הציטופלסמה כך ששינויים בגודל ובצורה של phagosome ניתן להעריך. זה מאפשר Fאו ניטור נוסף של תנועה יונית.

Introduction

נויטרופילים הם תא החיסון המולד בשכיחותו בגוף. תפקידה העיקרי שלו מורכב המסיירים הדם ואת ומלטפות, מעכלים את החלקיקים הזרים כי היא עשויה להיתקל בתהליך המכונה phagocytosis ^{1, 2.} החלקיקים מפורקים בתא של תאיים שנקרא phagosome. הפעלת האנזים מונואמין NADPH נויטרופילים, את NOX2 איזופורם, יוזם מפל של תגובות ביוכימיות המסתיימת במותו של הפתוגן. יחידות משנה חלבון NOX2 להמשיך לגבש מורכבת שרשרת העברת אלקטרונים בקרום phagosomal ^3. לאחר הפעלה, זה מעביר אלקטרונים מן NADPH דרך הממברנה לחמצן מולקולרי בתוך phagosome, הפקת אניוני דיסמוטאז ומיני חמצן תגובתי נוספת. תופעה זו ידועה בשם פרץ הנשימה, והוא נחשב חיוני הרג חיידקים יעיל בעיכול ² </sup>. עם זאת, תנועה בלעדית זו של מטען שלילי על פני הקרום שבקרוב להשבית NOX2 אם זה לא יפוצה על ידי מטען חיובי נעים ו / או מטען שלילי נע מתוך phagosome. זה הוכח גם כי הרוב המכריע של פיצוי תשלום נויטרופילים מתבצע על ידי ערוץ הפרוטון ^{4 HVCN1, 5.} ערוץ זה מאפשר תנועה פסיבית של פרוטונים לאורך שיפוע אלקטרוכימיים שלהם מן cytosol לתוך phagosome. ריכוז Proton משתקף על ידי pH, כך על רמה מסוימת של פעילות אנזים מונואמין, מדידת pH של phagosome יכול לספק מידע על ההשתתפות היחסית של מסלולי protonic ולא protonic כפיצוי תשלום.

Phagosome נויטרופילים האנושי יש pH בסיסי של כ 8.5 עבור 20-30 דקות לאחר phagocytosis ^5. זה מרמז על קיומו של תעלות יונים הלא-פרוטונים נוספים NOX2-induced פיצוי תשלום, כמו פיוז'ן ושחרור תכולתו של גרגרי חומצי ופיצוי בלעדי ידי HVCN1 ישמור בסביבת חומצית, בניגוד לזה שנצפה. התנועה של יונים לפצות מטען שלילי זה עשוי גם להפעיל שינויים בגודל phagosome באמצעות אוסמוזה. יונים יכול להיות אלה הנמצאים נויטרופילים בריכוזים פיסיולוגיים גבוהים: יוני אשלגן הוכחו לנוע לתוך phagosome ^6, ותנועה יונית כלוריד היא עוד מועמד חשוב נויטרופילים פונקציה ^7.

הסדרת pH של phagosome חיונית עבור פעילות הפרוטאז מיקרוביאלית ^5. Myeloperoxidase (MPO) נראה שיש פעילות אופטימלית ב- pH 6, בעוד שעבור cathepsin G ו אלסטט, רמות אופטימליות הן pH 7-9 ו pH 8-10, בהתאמה ^5. לכן, שינוי חולף ב pH phagosomal עשוי לספק נישות פעילות אנזימים שונים כיףction. הבנה כיצד pH מעורב בהרג חיידקים נויטרופילים עשויה לספק מידע שימושי עבור העיצוב של סוכני מיקרוביאלית רומן משלים-נויטרופילים.

Phagosome נויטרופילים היא סביבה מאוד תגובתי. זה עושה את זה קשה להעריך במדויק pH, בגלל צבע ניתן חמצון בקלות, מה שמוביל חפצים טכניים. מבחינה היסטורית, isothiocyanate והעמסת (FITC) כבר צבע של בחירה למדוד תאיים pH ^{8, 9.} עם זאת, יש כמה חסרונות לשימוש שלה במדידת pH נויטרופילים phagosomal. יש לה pKa של 6.4 ^10, מה שאומר שזה יכול במדויק רק לשמש כדי להעריך את רמות מה PH 5 עד 7.5 ^8, כמו מרווה ב- pH <8 ^11. כמו pH נויטרופילים phagosomal יכול להיות הרבה יותר אלקליין ^5, FITC לא יכול ללכוד מגוון רחב של שינויים pH פוטנציאל. Signifi נוספתהבעיה צביעות עם FITC בהקשר של נויטרופילים היא שזה נחשב להיות photobleached ידי MPO ^12. מעכב MPO, יזיד הנתרן, יכול לשמש כדי להגביל photobleaching ^13, אבל זה הוכח כי יזיד הנתרן ישירות מוריד את רמת חומציות phagosomal באופן MPO עצמאי ולכן היא בלתי הולמת לשימוש מבחנים כגון ^5.

לעומת צבעי תאיים אחרים, S-1 יש pKa גבוה יחסית של 7.5 ^10. בתנאים חומציים, המולקולה היא protonated ומייצרת אות פליטה בין 560 ו 600 ננומטר כאשר נרגש על 488 ננומטר ומעלה. כאשר המולקולה היא deprotonated בלמעלה תנאי בסיסי, גל הפליטה נגמר 600 ננומטר. יחס של עוצמות הקרינה בשני אורכי גל אלה מצביע על שינוי הפליטה, המהווה יותר הוא אמין יותר מאשר מדידות קרינה יחידות, כפי שהוא אינו מושפע על ידי ריכוז fluorophore ואת מבנה תא. S-1 ניתן מצומדות חומר אנטיגני, כגון zymosan ^14, אם כי-הרג חום (HK) קנדידה אלביקנס היא מועדף, שכן שטח הפנים הגדול יותר נותן קריאת קרינה עקבית יותר.

השתמשנו גם שינוי של השיטה בחקר שינויים זמניים ב pH (איור 3) ^5. שיטה זו למדידת pH cytosolic ניתן ליישם בקלות סוגי תאים אחרים, כמתואר במקום אחר ^{15, 16,} ו תאים עם phagosomes אלקליין יותר ^14.

Protocol

בהצהרת אתיקה: כל עבודת החיה נערכת עם הרישיון והאישור של משרד פן בריטניה. השתתפות אדם במחקר זה אושר על ידי ועדת UCL המשותפת / UCLH על האתיקה של מחקר אדם. כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת. 1. הכנת ג אלביקנס לגדול דיסק קנדידה (ראה רשימת חומרים) על צלחת אגר YPD לפי הוראות היצרן. פיק מושבה ולהוסיף אותו 15 מ"ל של מרק YPD. דגירה זה חממה רועד ב 30 ° C ו 200 סל"ד עד שהמרק הוא מעונן (בדרך כלל על 2 ימים, או לריכוז של בערך מעל 1 x 10 9 / מ"ל). ספין למטה המדיום קנדידה מחדש להשעות אותו 50 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מניחים את הצינור המכיל 50 מ"ל של מדיום PBS / קנדידה באמבט מים שחומם מראש ל 60 מעלות צלזיוס, כך הצינור כולו הוא יםubmerged עבור 1 h. כדי לאשר כי קנדידה הם-הרג חום, פס מדגם לצלחת אגר YPD ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. התאם את-הרג חום (HK) ריכוז קנדידה כדי 5-9 x 10 8 / מ"ל, תלוי צמיחה קנדידה, ולאחסן אותו 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C במקפיא. הערה: כל ספירת התאים בפרוטוקול זה בוצעה באמצעות דלפק תא אוטומטי. 2. S-1 צימוד חום-הרג (HK) קנדידה הכן aliquot של carboxy-S-1 אסתר succinimidyl (50 מיקרוגרם) על ידי דילול אותו 100 μL של sulfoxide דימתיל בדרגה גבוהה (DMSO). וורטקס היטב כדי לערבב. הכן 1 מ"ל של 1 x 10 8 קנדידה HK ב 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3) בצינור 15 מ"ל. הוספת 100 μL של carboxy-S-1 טיפה אחת בכל פעם, כדי קנדידה HK תוך ערבוב על מערבולת בערך 2000 סל"ד (בינוני עד מהיר). גלישת אלומיניום foil סביב הצינור ולמקם אותו על רולר בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה. לשטוף שלוש פעמים HK Candida- S-1 (HKC-S-1) על ידי צנטריפוגה ב 2250 XG במשך 10 דקות כל אחד. בשנתי השטיפות הראשונות, להשעות את הגלולה ב 15 מיליליטר של 0.1 M סודיום ביקרבונט (pH 8.3). לאחר לשטוף השלישי, להשעות אותו 1 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ (ראה טבלה 1). העברת HKC-S-1 ההשעיה לתוך צינורות ב 100 aliquots μL ולאחסן אותם ב -20 ° C. הערה: צינורות משתמשים עם משטח נמוך מחייב חומר, ואם אפשר, כפי HKC-S-1 חלקיקים יכולים להיצמד לקיר של צינורות צנטריפוגה נורמלים. Opsonize HKC-S-1 עבור נויטרופילים האדם, להוסיף 100 μL של נסיוב אדם IgG ל 100 μL של HKC-S-1 מופשר. עבור נויטרופילים עכבר, להוסיף 50 μL של סרום עכבר רגיל 50 μL של בסרום חיסוני עכבר קנדידה (המופקים עכברי C57B6 מוזרקים עם קנדידה HK) 5 כדי 100 μLשל HKC-S-1. מערבבים אותו על-שייקר חום ב 37 ° C ו- 1100 סל"ד במשך 60-90 דקות, ולאחר מכן על רולר C 4 ° עבור 2 h. שלוש פעמים לשטוף במאגר BSS על ידי צנטריפוגה ב 17,200 XG במשך 1 דקות כל אחד. גלולה ב 100 μL של חיץ BSS. 3. בידוד של נויטרופילים עבור נויטרופילים בדם ההיקפי האנושי, לקחת 15 מ"ל של דם על ידי venipuncture מתורם בריא ולמקם אותו לתוך מזרק 20 מ"ל המכיל 90 μL של 1000 פתרון נתרן הפרין IU / מ"ל ​​(60 μL של הפרין / 10 מ"ל של דם). בעזרת קצה פיפטה, להזריק 1.5 מ"ל של פתרון dextran 10% לתוך המזרק. הפוך אותו בעדינות 3 פעמים ולהשאיר אותו עומד זקוף על הספסל. המתן 30-60 דקות, עד שהדם מתפרקים לשני חצאים, עם שכבת מעיל באפי העליון כי הוא בצבע קש שכבה בתחתית המכיל אריתרוציטים. לחץ בעדינות את השכבה העליונה באמצעות מחט או להסיר אותו עם קצה פיפטה. שים את זה אניצינור נה 15 מ"ל. להימנע מלקחת את השכבה האדומה. בעזרת פיפטה מ"ל 5, להוסיף 3-4 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (ראה רשימת חומרים) לחלק התחתון של הצינור מתחת לשכבת מעיל באפי להשיג שתי שכבות נפרדות. צנטריפוגה ב 913 XG במשך 10 דקות. הערה: אם נויטרופילים עכבר באמצעות (ראו התייחסות 17 לעכבר נויטרופילים בידוד), להשתמש השעית התא כי כבר סמוקה ממח העצם במקום. יוצקים את supernatant, ומשאיר מאחור גלולה אדומה. בעדינות מערבולת להפריע גלולה. להוסיף 7 מ"ל של מזוקקים, לעקר H 2 O ל גלולה ו להפוך עבור 20 s כדי להשעות את גלולה. להוסיף 7 מ"ל של סליין 2x ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב, lysing בתאי הדם האדומים שנותרו. צנטריפוגה XG 300 5 דק '. יוצקים את supernatant מחדש להשעות גלולה במאגר BSS כ 4 x 10 6 / מ"ל. הערה: למיקרוסקופיה האופטימלי של התאים, לשמור על ריכוז השעית תא בין 1.5-6 x 10 6 </sup> / מ"ל. 4. הכנת שקופיות טרום לטפל צלחת מיקרוסקופיה 8 היטב (ראה רשימת חומרים) עם 200 μL של L- ליזין פולי (פתרון 0.01%) בכל טוב עבור 40-60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את L- ליזין פולי (ניתן לעשות שימוש חוזר) ולשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של H 2 O. מזוקקים הוספת 200 μL של תאי השעיה מוכנות בשלב 3.6 זה טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות. הכן aliquot של 5 (ו-6) acetoxymethyl S-1 -carboxy (S-1-AM) אסתר (50 מיקרוגרם) על ידי הוספת 100 μL של DMSO בדרגה גבוהה כדי צינור אחד. וורטקס לערבב. כאשר אינו בשימוש, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. בתוך צינור קטן, להוסיף 1.7 מ"ל של חיץ BSS ו- 20 μL של S-1-AM. וורטקס לערבב. לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS, ולאחר מכן להחליף את החיץ עם הפתרון S-1-AM. יש להיזהר שלא להפריע בשכבה של תאים המחוברים לתחתית הבאר ידי בעדינות pipettingלאורך הקירות של הבארות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 25 לפחות. לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 μL של חיץ BSS. כדי לבחון מעכב, לפצות על "תערובת מאסטר" של התרופה המתאימה חיץ BSS. לשטוף את הבארות פעמי הפתרון המעכב. הערה: הקפד להשתמש באותה כמות של הרכב התרופה (למשל, DMSO או אתנול) בבקרה גם שימש מעכב. אם בוחנים את ההשפעה של כלוריד אבץ, להשתמש במאגר BSS חסר KH 2 PO 4 (את HEPES יכול חיץ הפתרון לבד), כמו אבץ משקעים עם פוספט. Sonicate HKC-S-1 opsonized (סעיף 6.2) למשך כ 3 שניות על מיקרומטר משרעת 5. להוסיף 10 μL היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות, כדי לאפשר phagocytosis, מה שהופך את התא מוכן להיות צלם עבור תמונות של phagocytosis. 5. מיקרוסקופיה confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתאים את אורך הגל לייזר כך thעל התאים נרגשים ב 555 ננומטר ואת הפליטה מזוהית על ידי שני ערוצים, או גלאי: 560-600 ננומטר ומעל 600 ננומטר. הערה: פרמטרים מיקרוסקופ ספציפיים יהיו שונים עבור כל מיקרוסקופ צריכים להיות מותאמת על ידי החוקר. הצג את התאים בעזרת עדשה 63X עם שמן. השתמש בתמונת אריח-סריקה על הגדרה רציפה כדי להציג את משבצת המרכז. באמצעות עוצמת הקרינה ורווח של ערוצי גלאי, לשנות את הפוקוס ואת עוצמת הלייזר ואת הרווח של שני הערוצים כדי לייעל את התמונה. לפצל את התמונה באמצעות הגדרות כדי להציג שני הערוצים; לבדוק שאין רוויה של עוצמת קרינה בציטופלסמה או וקואולות. רוויה מופיעה כנקודות אדומות. להפחית את עוצמת הלייזר כך שיש מספר מינימלי של נקודות אדומות, אבל התאים phagosomes הם חכמים מספיק כדי לראות בבירור. כשתהיה מרוצה, לחץ על "התחל ניסוי." תמונת סריקה 9 אריח נוצרת. שמור את התמונה כקובץ מורכב המומלץ על ידיהתוכנה המכילה תמונה מורכבת של שני הערוצים (לא JPEG או TIFF). 6. ניסויי כיול בניית עקומת סטנדרט pH עם קנדידה לבד. הכן את החוצצים בין pH 3.0 כדי 13.0, לפי טבלה 1. קח aliquot אחד (100 μL) של HKC-S-1. לסובב אותו על 1 דקות ב g 17,200 x. Resuspend אותו 500 μL של חיץ שהוקצו. החל מ טווח pH הנמוך ביותר, להוסיף את ההשעיה לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2). מניחים את השקף על מיקרוסקופ confocal על הבמה מחוממת מוגדר 37 ° C. רשום את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ. עקומת סטנדרט Saponin. לבודד 1 x 10 7 נויטרופילים האנושי 5 resuspend אותם 1 מ"ל של חיץ pH הנמוך ביותר. בצע את השיטה המתוארת בסעיף 4 למדידת ppH hagosomal ב נויטרופילים. לאחר הדגרה עם ההשעיה קנדידה עבור 20 דקות, להוסיף 0.3% saponin (15 μL של 10% במלאי לאחד טרום יחס טוב (משלב 4.2)) על הצלחת, ואז דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. קח תמונה כל דקה במשך 10 דקות. חזור עבור כל חיץ. עקומות סטנדרטיות pH Cytosolic באמצעות הגבוהה K + / nigericin טכניקה 5, 18, 19. איפור מאגרים שמתואר בטבלה 1, מ pH 4.0 כדי 13.0. בצע את פעולות 4.1-4.7, עוזב נויטרופילים רק הבארות טרום טיפול – כל טוב להכיל חיץ שונה. מוסיף את השקף אל הבמה המחוממת 37 מעלות צלזיוס ולהקליט את הקרינה בכל דקה במשך 10 דקות. הערה: זה עלול לקחת קצת זמן עבור ה- pH cytosolic לייצב עם הפתרון החיצוני, אך לאחר נקודה זו, ערך היחס S-1 הופךקָבוּעַ. מדידת HKC-S-1-התאים בכל ניסוי יכולה לשמש כביקורת לבדוק שכל מעכבים הוסיפו לא להפריע הקרינה הנפלטת S-1 או להשפיע על רמת החומציות של עור החיץ. ניתוח תמונה 7. הערה: הנה, הוראות לניתוח תמונה (לכמת הקרינה) באמצעות ImageJ התוכנה החופשי מסופקת. שימוש ImageJ מומלץ. הורד והתקן גרסה ImageJ> 1.46r בהתאם להנחיות של היזם (https://imagej.nih.gov/ij/). התקן את קובץ קוד המשלים מצורף עם פרוטוקול זה נקרא "מדידת Phagosomal." פתח תמונה J ו לטעון את קובץ התמונה שנבחרה לניתוח על הכלים. כדי לשלב את שני הערוצים, להשתמש Image> צבע> הפוך מרוכבים. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור קובץ בו כדי לאחסן תוצאות. לחץ על כלי הקו בסרגל הכלים ולחצו לחיצה כפולה על מנת להגדיל את הרוחב ל & #34; 2 ". צייר קו לרוחב של phagosome, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על "pH מידה". עוצמת הממוצע של שני ערוצי נרכש, ואת היחס שלהם מחושב באופן אוטומטי על ידי קובץ קוד ImageJ. לאחר שסיים את המדידות, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "לשמור את הקובץ." כדי למדוד את שטח phagosome, השתמש בסמל הרביעי יחד בסרגל הכלים לצייר ביד חופשית מסביב לאזור. לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור "אזור מידה." הערה: התוצאות נשמרות בקובץ יומן נוצר בתיקייה הנבחרת. התוצאות עשויות להיות מעובד באמצעות גיליון אלקטרוני, R, או תוכנה מקבילה. הקשר בין יחס קרינת pH הוא כ sigmoidal, ואת ערכי היחס שנוצרו על ידי ניתוח ImageJ ניתן להמיר pH באמצעות פונקצית סיגמואיד כללית או לוגיסטית או על ידי ליניארי או אינטרפולציה שגם מעוקב. כדי למדוד הציטופלסמה, למתוח קו על פני הציטופלסמה לבין לחץ לחיצה ימנית על "pH מידה".

Representative Results

Figure 1 presents snapshots of neutrophils from different origins to demonstrate varying phagosomal environments. To ease quantitative analysis, it is important to seed the wells with an appropriate number of cells: too many will cause the cells to layer over each other, making it difficult to view enclosed phagosomes accurately; too few will, of course, provide fewer results, particularly as not every neutrophil will phagocytose. Figure 2 is an image that is over-saturated; this can be assessed by splitting the image between its two channels (using the microscope software recommended in the Materials List or an equivalent) — red dots show where maximum fluorescence has been detected. This can be countered by reducing the intensity of the laser. Calibration curves using the various buffer systems are shown in Figure 3, adapted from Levine et al.5. The error bars show that there is some variation in fluorescence between readings. Figure 4 gives an example of how the data for phagosomal pH and area could be presented. This approach allows each individual measurement to be displayed with an over-laying boxplot. However, the data could also be displayed in a histogram bar chart. Figure 1: Appropriate snapshot images of neutrophils from humans and mice. To the far right is a qualitative visual key of the approximate color of the S-1-stained phagosomes corresponding to the pH. The yellow color indicates more acidity, while red indicates more alkalinity. (A) shows Hvcn1-/- mouse bone marrow neutrophils 20 min after phagocytosis. The phagosomes appear very red, alkaline, and swollen. The red arrow in the bottom right part of the image points to an intracellular Candida, while the arrow in the top left points to an extracellular particle. (B) shows wildtype mouse bone marrow neutrophils that have ingested Candida; they are much less alkaline than Hvcn1-/- cells. (C) shows human peripheral blood neutrophils at the same point after phagocytosis. They appear slightly more alkaline than the mouse wildtype cells, but the phagosomes are still not as large and red as the Hcvn1-/- cells. (D) shows human neutrophils that have phagocytosed Candida in the presence of 5 µM diphenylene iodonium (DPI). All the phagosomes are very acidic, with a pH of 6 or less; the drug inhibits the NADPH oxidase, so there is no compensatory ion movement. The protons released from the acidic granules that fuse to the phagosome cause the acidic pH20, and increased recruitment of the V-ATPase to the phagosomal membrane upon treatment with DPI9. The cytoplasm also appears more alkaline compared to the cells from the other conditions. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2: Over-saturation of Hvcn1-/- mouse bone marrow neutrophils. It is important to exclude from the analysis images in which the fluorescence data are over-saturated. As described in section 5.3, the composite image is split into two images (top left, red arrow) with both channels presented individually. In this software, range indicator is checked on (bottom left, red arrow), then any pixels which are over-saturated are bright red. There is over-saturation present in both channels (1 and 2). A magnification of some cells and extracellular Candida is shown at the bottom right, with arrows pointing to affected areas. Analyzing these points would lead to a false ratiometric measurement. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3: Standard calibration curves for the conversion of S-1 fluorescence ratios to pH measurements. The standard curves for Candida alone in the different buffers (labeled as "Tris") and when the cells are permeabilized with saponin ("Saponin") are very similar, showing that the S-1 reading inside and outside the cell (phagosome and extracellular medium) are comparable. The error bars represent the mean ± SD. The S-1 ratio/pH curve is shortened when tested in the cytoplasm ("Cytoplasm"), which should be taken into consideration in the image analysis. This figure has been modified from Levine et al.5. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4: Quantification of phagosomal pH and area. This figure presents an example of data presentation. The graphs were generated using the programming software R. A: shows phagosomal ratio and corresponding pH for A (Hvcn1-/- mouse bone marrow neutrophils), B: wildtype mouse bone marrow neutrophils, C: human peripheral blood neutrophils, and D: human neutrophils with 5 µM DPI n = 3/300. Individual measurements are shown as small squares, with an overlaying boxplot with median and interquartile range. A red bar represents the mean. As seen in the images in Figure 1, Hvcn1-/- cells have very alkaline phagosomes in comparison to wildtype mouse and human neutrophils. They also have a bigger phagosomal area (Figure 4B, n = 3/300). Human neutrophil phagosomes are slightly more alkaline and larger than wildtype mouse neutrophils, while human neutrophils incubated with DPI have very acidic and small phagosomes. Please click here to view a larger version of this figure. Balanced salt solution (BSS) buffer NaCl 156 mM KCl 3 mM MgSO4 2 mM KH2PO4 1.25 mM CaCl2 2 mM Glucose 10 mM Hepes 10 mM pH 7.4 with NaOH or HCl YPD broth YPD broth 50 g Distilled water 1 L Autoclave at 121 °C for 15 min For YPD agar: before autoclaving add 15 g/L agar 10% Dextran solution Dextran clinical grade 50 g NaCl 4.5 g Distilled water 500 mL Add to glass bottle and autoclave at 121 °C for 15 min 2x Saline solution NaCl 18 g Distilled water  1 L Add to glass bottle and autoclave at 121 °C for 15 min 10% Saponin stock BSS buffer 50 mL Saponin 5 g Heat BSS buffer to 37 °C, add saponin and mix. Add 0.1% sodium azide as preservative, store mixture at 4 °C. Calibration buffers Candida standard curve First make up 0.15 M stock of each buffer Make up 0.15 M NaCl solution 15 mL final volume: 5 mL 0.15 M of desired buffer solution + 10 mL 0.15 M NaCl solution pH 3 100 mM NaCl 50 mM glycine pH 4 100 mM NaCl 50 mM acetate pH 5 100 mM NaCl 50 mM acetate pH 6 100 mM NaCl 50 mM acetate pH 7 100 mM NaCl 50 mM Tris pH 8 100 mM NaCl 50 mM Tris pH 9 100 mM NaCl 50 mM Tris pH 10 100 mM NaCl 50 mM glycine pH 11 100 mM NaCl 50 mM phosphate pH 12 100 mM NaCl 50 mM phosphate pH 13 100 mM NaCl 50 mM phosphate Cytosolic standard curve Use previously made 0.15 M stock buffer solutions Make up 0.15 M KCl solution 15 mL final volume: 5 mL 0.15 M of desired buffer + 10 mL 0.15 M KCl solution 10 mM stock of nigericin in ethanol, add 15 µL to each final volume solution pH 3 100 mM KCl 50 mM glycine 10 µM nigericin pH 4 100 mM KCl 50 mM acetate 10 µM nigericin pH 5 100 mM KCl 50 mM acetate 10 µM nigericin pH 6 100 mM KCl 50 mM acetate 10 µM nigericin pH 7 100 mM KCl 50 mM Tris 10 µM nigericin pH 8 100 mM KCl 50 mM Tris 10 µM nigericin pH 9 100 mM KCl 50 mM Tris 10 µM nigericin pH 10 100 mM KCl 50 mM glycine 10 µM nigericin pH 11 100 mM KCl 50 mM phosphate 10 µM nigericin pH 12 100 mM KCl 50 mM phosphate 10 µM nigericin pH 13 100 mM KCl 50 mM phosphate 10 µM nigericin pH all calibration solutions with either HCl or NaOH Table 1: Composition of buffers. This table describes the appropriate compositions of the different buffers used in the protocol. Supplementary code file. This file contains a number of macros, written by A. P. Levine, which are necessary for image analysis. The authors would be happy to try to address any queries associated with using this code. Please click here to download this file.

Discussion

Once the appropriate reagents, microscope settings, and calibration experiments are set up, this method is relatively simple to perform. The critical steps include: labeling the Candida with S-1 to ensure that there is no overloading of the dye, calibrating, and analyzing the image.

S-1 is a reagent suited to more alkaline pH environments, which is particularly important for neutrophils²¹ but limits its use in certain cell types. For more acidic environments, such as macrophage phagosomes, SNARF-4, or S-4, is more suitable because of its lower pKa²². Moreover, for more accurate cytoplasmic readings, it is better to use S-4, as the standard curve for S-1 shows that fluorescence ratios begin to plateau below pH 6 (Figure 3). Other dyes, such as 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF) or pHrodo Red may also be more suitable in a context that is expected to be acidic. Yet the cytoplasm staining is still necessary for correct identification of the phagosomes containing Candida.

An important feature of a phagosomal pH indicator is that it is not irreversibly altered by the reactive phagosomal environment. S-1 seems to be resistant to the neutrophil milieu. This is shown by Levine et al.⁵ (see Supplementary Video 4 of reference⁵) which demonstrate the phagocytosis and subsequent release of an S-1-labeled Candida particle by an Hvcn1^-/- neutrophil. When phagocytosed, the particle turns from yellow/orange to red (neutral to alkaline pH), but when the particle is released by the neutrophil, it returns to its original color.

It is important to mention some of the limitations associated with using S-1. The fact that this dye has two emission spectra allowing ratiometric measurement is an advantage, but specialist equipment is needed to acquire images; the microscope used for the experiments must be able to record two images simultaneously or with an insignificant time delay. The authors assume that the researcher attempting this protocol has experience using confocal microscopy, or has access to a trained professional. We cannot list all the specific microscope parameters as they will differ for each microscope and need to be optimized by the researcher. The acetoxymethyl ester conjugated to S-1 that allows the dye to diffuse into the cell cytoplasm is degraded by non-specific esterases in the cell cytoplasm to form the fluorescent molecule. Esterases, such as alkaline phosphatase, are present in human serum and fetal bovine serum, which are used to supplement cell culture media. Accordingly, the medium in which the cells are loaded with S-1-AM (section 4.5) must not contain serum. This may prove challenging if using cells that require a more nutrient-rich medium to sustain them than the balanced salt solution used throughout this protocol. Similarly, other fluorescent medium components, such as phenol red, may interfere with S-1 measurements.

The error bars in Figure 3 indicate that there is some variation in the ratio measurements at each pH. A suitable number of repeats of each experiment (at least n = 3) and as many individual measurements in each single experiment are needed to overcome the inter-vacuolar variation. It is thus advisable to measure the pH of at least 100 phagosomes for each condition and as many phagosomal areas that appear to contain only one Candida. The phagosomes to be measured for quantitation should be those that have completely engulfed a Candida particle (i.e., those completely surrounded by cytoplasm). To mitigate against unintentional biases in the selection of cells/phagosomes for quantitation, all analyses should be performed while blind to the experimental conditions.

Here, we describe the isolation of neutrophils by dextran sedimentation of whole blood followed by centrifugation of the plasma layer through a density gradient. We use this technique as it quickly and efficiently produces a pure (>95%) population of neutrophils, although there are other methods available, such as whole blood centrifugation through other density gradient formulas or negative selection of neutrophils using specialist kits with antibodies or magnetic beads. However, the latter can be prohibitively expensive for most groups who isolate neutrophils routinely. In addition, we use the anticoagulant heparin in the blood-collecting tube, whereas other researchers may be more accustomed to using ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or acid citrate sodium (ACD). As there are many different methods to choose from, it is up to the personal preference of the researcher.

Furthermore, when isolating and manipulating neutrophils they should be handled with some care to avoid excessive activation. Precautionary steps include: only using plastic ware, no glass; filter-sterilize all buffers to remove any contaminating endotoxin; when spinning neutrophils make sure the centrifuge is well balanced to avoid excessive vibrations; limit as much as possible the time neutrophils remain in a pellet after centrifugation; do not maintain neutrophils in solution of more than 5 x 10⁶/mL; and perform the experiment as soon as possible after isolation.

This method can be adapted to measure changes in the pH and phagosomal area over time by using a heated stage set to 37 °C on the microscope and taking snapshots once every 30-60 s from the same position, as described for the calibration steps. It could also theoretically be adapted for higher-throughput experiments, such as in 96-well plates, and for flow cytometry experiments, where S-1 can be used as a pH indicator²³. However, in these settings, the emphasis on individual cell activity is replaced by a more global effect on the cell population.

This method aims to provide a relatively simple experimental setup upon which individual researchers can adapt to suit their area of interest. Researchers may want to explore neutrophil phagosomal pH and area whilst also measuring movement of other ions, for example, intracellular calcium concentration. There are several fluorescent Ca²⁺ indicators readily available for confocal microscopy, such as Indo-1, which also has dual emission spectra at 400 and 475 nm²⁴. These emission wavelengths do not overlap with S-1 emission spectra, but the excitation wavelength is at the ultraviolet (UV) end of the spectrum, which can be damaging to cells, and a UV laser is not commonplace on all microscopes. A comprehensive review of the different indicators to measure intracellular calcium flux is covered by Takahashi et al.²⁵ and Hillson et al.²⁶.

In conclusion, there are other methods available to measure phagosomal pH using different fluorescent dyes as Nunes et al. have demonstrated¹³ as well as other groups^27,28. Other researchers have also used S-1 to measure cytosolic pH²⁹ or phagosomal pH¹⁴. However, this protocol is unique in measuring simultaneously the pH of both cytosol and phagosome, which provides the opportunity to observe changes in phagosomal cross-sectional area and to distinguish between wildtype and Hvcn1^-/- mouse neutrophils, and human neutrophils with and without a working NADPH oxidase.

Materials

Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU	Sigma-Aldrich	RQC14003-10EA	Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth	Sigma-Aldrich	Y1375	Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000	MP Biomedicals	2101514	Use gloves
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml	Fannin, Wockhardt UK Ltd	FP1077	We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging	Thermo Scientific/Invitrogen	SS22801	Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	Thermo Scientific/Invitrogen	C1272	Use gloves
Vivaglobin human IgG  160mg/ml solution	CSL Behring	received as a gift	Various providers exist
Normal mouse serum	Abcam	ab7486	Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium)	Alere Ltd	1114547	Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Various providers exist
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	Various providers exist
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Various providers exist
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086	Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine	Sigma	P4707	Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)	Carl Zeiss		The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat	Thistle Scientific	IB-80826	Other appropriate imaging dishes can be substituted
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well	World Precision Instruments	FD35-100	Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available
Soniprep 150	MSE		Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter	BioRad		Various providers exist
1.5ml Protein LoBind Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA	Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs