تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
السيطرة متعدية يبرز بوصفه خطوة هامة على حد سواء لتنظيم النسخي في التعبير الجيني، وخصوصا خلال فترات الإجهاد الخلوي 1. وهناك نقطة محورية في السيطرة الترجمة في الحد من معدل خطوة من الشروع حيث تتضمن الخطوات الأولى لتخليق البروتين الربط من حقيقيات النوى عامل بدء 4E (eIF4E) إلى methylguanosine 7 (م 7 GTP) 5 'السقف من من mRNAs 2 . eIF4E هو جزء من مجمع مثلوثي اسمه eIF4F يتضمن eIF4A، وهو هيليكاز RNA، وeIF4G، وهو بروتين السقالات اللازمة لتوظيف العوامل الترجمة الأخرى و40S الريبوسوم 3. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، ويتم تحويل الغالبية العظمى من من mRNAs عبر آلية تعتمد على كأب، ولكن في ظل فترات من التوتر الخلوي حوالي 10٪ من من mRNAs الإنسان يحتوي على 5 'UTRs والتي قد تسمح ترجمة مستقلة غطاء intiation 1،4. وكانت الترجمة التي تعتمد على غطاء مرادف تاريخياالأوس مع eIF4F، ومع ذلك، فقد أصبحت الاختلافات الإجهاد محددة من eIF4F موضوع تتجه 5-8.
الضغوط الخلوية المختلفة تسبب النشاط eIF4E إلى أن قمع عن طريق الهدف الثدييات من rapamycin مجمع 1 (mTORC1). هذا كيناز يصبح ضعف تحت الضغط، مما يؤدي إلى زيادة نشاط واحد من أهدافها، والبروتين 4E ملزم (4E-BP). غير فسفرته 4E-BP يربط eIF4E وكتل قدرتها على التفاعل مع eIF4G مما تسبب في القمع التي تعتمد على غطاء الترجمة 9،10. ومن المثير للاهتمام، وhomolog من eIF4E اسمه eIF4E2 (أو 4EHP) لها قابلية أقل بكثير عن 11 4E-BP، وربما السماح لها للتهرب من القمع بوساطة التوتر. في الواقع، يتميز في البداية باعتباره كاظمة الترجمة نظرا لعدم تفاعلها مع eIF4G 12، eIF4E2 يبدأ ترجمة مئات من mRNAs التي تحتوي على عناصر استجابة نقص الأكسجة الحمض النووي الريبي في بلدانهم UTR 3 أثناء الإجهاد ميتة 6،13. هذا التنشيط طق تحققت من خلال التفاعل مع eIF4G3، RNA ملزم البروتين عزر 4، ونقص الأكسجة عامل محرض (مؤسسة الحرمين) 2α تشكل مجمع eIF4F ميتة، أو eIF4F H 6،13. ونتيجة لكاظمة في ظل ظروف طبيعية، eIF4E2 يربط مع GIGYF2 وZNF598 14. تم، في جزء منه، حددت هذه المجمعات من خلال مرتبطة الاغاروز م 7 راتنجات GTP تقارب. هذا الأسلوب الكلاسيكي 15 هو المعيار في مجال الترجمة وهو المقايسات الأفضل والأكثر استخداما تقنية لعزل المجمعات ملزم الغطاء في المنسدلة وفي المختبر ملزمة 16-19. بوصفها الآلية الترجمة التي تعتمد على الغطاء يبرز بوصفه مرنة وقابلة للتكيف مع أجزاء المتغيرة بين 6-8،13، وهذا الأسلوب هو أداة قوية لتحديد بسرعة البروتينات ملزم غطاء رواية المشاركة في الاستجابة للضغط النفسي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاختلافات في eIF4F آثار واسعة كما تظهر عدة نظم نموذج حقيقية النواة لاستخدام homolog eIF4E2 لاستجابات التوتر مثل هذهكما A. thaliana 20، S. Pombe 21، D. البطن 22، وجيم ايليجانس 23.
تشير الدلائل إلى أن الاختلافات في eIF4F قد لا يكون مقتصرا فقط على ظروف عصيبة، ولكن أن تشارك في علم وظائف الأعضاء العادي 24. إمدادات الأوكسجين إلى الأنسجة (على طرفي الشعرية) أو داخل أنسجة (قياس عبر الميكروية) يختلف 2-6٪ في الدماغ 25، 3-12٪ في الرئتين 26، 3،5-6٪ في الأمعاء 27، 4٪ في الكبد 28، 7-12٪ في الكلى 29، 4٪ في العضلات 30، و6-7٪ في نخاع العظام (31). الخلايا والميتوكوندريا تحتوي على أقل من 1.3٪ أكسجين 32. هذه القيم هي أقرب إلى نقص الأكسجين من الهواء المحيط حيث الخلايا مثقف بشكل روتيني. وهذا يشير إلى أن ما كان يعتقد في السابق على أنها قد تكون العمليات الخلوية نقص الأكسجة محددة ذات صلة في إعداد الفسيولوجية. ومن المثير للاهتمام، eIF4F وeIF4F H </sup> والمشاركة بنشاط في بدء ترجمة حمامات متميزه او فئات من mRNAs في العديد من مختلف خطوط الخلايا البشرية تتعرض للأوكسجين الفسيولوجية أو "physioxia" 24. يدفع انخفاض الأكسجين أيضا نمو الجنين السليم 33 ولها خلايا عموما أعلى معدلات انتشار الأسلحة النووية، أعمار أطول، وأقل الحمض النووي من التلف وأقل استجابات التوتر العام في physioxia 34. لذلك، من المرجح eIF4F H عاملا أساسيا في التعبير عن جينات محددة في ظل الظروف الفسيولوجية.
هنا، ونحن نقدم على بروتوكول لخلايا الثقافة في ظروف الأكسجين الفسيولوجية ثابتة أو في نطاق تذبذب الديناميكية التي من المرجح أكثر تمثيلا للmicroenvironments الأنسجة. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أن الخلايا هي lysed داخل محطة نقص الأكسجة. انها ليست في كثير من الأحيان من الواضح كيف يتم تنفيذ عملية الانتقال من ثقافة خلية ميتة إلى تحلل الخلايا في البروتوكولات الأخرى. وغالبا ما يتم إزالة الخلايا الأولى من حاضنة نقص الأكسجة الصغيرة يكونالصدارة تحلل، ولكن هذا التعرض للأكسجين قد يؤثر على المسارات البيوكيميائية مثل استجابة الخلايا للأوكسجين سريعا (واحد أو اثنين دقيقة) 35. تتطلب بعض البروتينات ملزم سقف التفاعل مع قاعدة الثانية أو يمكن أن يتحلل من GTP م 7، لذلك قد يكون غاب بعض interactors سقف في عملية التنقية. قد تكون بديلا الاغاروز مرتبطة إلى النظير غطاء مقاومة إنزيمي في هذا البروتوكول. سوف استكشاف النشاط وتكوين eIF4F H والأشكال الأخرى من eIF4F من خلال الطريقة الموصوفة هنا تسليط الضوء على معقدة وآليات التعبير الجيني التي تستخدم الخلايا خلال الظروف الفسيولوجية أو استجابات التوتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل البروتينات ملزم الغطاء في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأكسجين الفسيولوجية يمكن أن تسمح لتحديد العوامل الترجمة بدء التنظيم الأكسجين جديدة. تقارب من هذه العوامل لغطاء 5 'من مرنا أو غيرها من البروتينات المرتبطة سقف يمكن قياس قوة ارتباطهم إلى m 7 GTP مرتبطة ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5′-3′ mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. . Hypoxia. , (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs–a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).
