Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Summary

Vi præsenterer en fremgangsmåde til isolering og dyrkning af muse Wolffian kanalen (WD). Vi viser også en detaljeret procedure for hele mount immunfarvning af dyrkede / frisk isolerede WDS med fluorescens mærkede antistoffer. Tilsammen udgør disse teknikker gør det muligt at studere WD udvikling, opvikling, og differentiering.

Abstract

Tubal morfogenese er en grundlæggende forudsætning for udviklingen af ​​de fleste pattedyr organer, herunder den mandlige reproduktive system. De epididymis, en integreret del af den mandlige reproduktive tarmkanalen, er ansvarlig for opbevaring af sæd, modning og transport. Den voksne epididymis er en meget coilrør der udvikler sig fra en enkel og lige embryonale precursor kendt som Wolffian kanal (WD). Korrekt oprulning af epididymis er afgørende for mandlige fertilitet, som sædceller i testiklerne ikke kan befrugte en oocyt. Men den mekanisme, der epididymis udvikling og oprulning er fortsat uklart, delvist på grund af manglen af ​​hele organkultur og billeddannende metoder. I denne undersøgelse beskriver vi et in vitro kultursystem og hele mount immunofluorescens protokol bedre at visualisere processen med WD oprulningen og udvikling, som også kan anvendes til at studere andre rørformede organer.

Introduction

Den mandlige reproduktive system består primært af testis, stedet for kimcelle udvikling og differentiering og et komplekst gangsystemet, der kræves for modningen, transport og opbevaring af sædceller. Epididymis er en rørformet organ, der forbinder testis med sædlederen og hovedsageligt involveret i post-testikelkræft udvikling og modning af kønsceller ^1. De stærkt coiled voksne mus epididymis udvikler sig fra en enkel og lige precursor rør, Wolffian kanal (WD) ^1. Komplekset og oprullede struktur epididymis er afgørende for sædcellerne at erhverve evnen til at befrugte kvindelige kønsceller ^2. Hvordan sådan en vigtig organ for mandlig fertilitet udvikler og kommer i form er ikke godt forstået. Forskellige signalveje er blevet vist at være involveret i udviklingen af WD såsom Wnt signalvejen ^3,4 og androgenet signalvejen ^5. Vores seneste arbejde har etableret kravet om balbalanceret Wnt signalering til WD oprulning under prænatal udvikling ^4. Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige for at forstå de mekanismer, der er involveret i postnatal epididymalt coiling, cellulær differentiering, og celle-til-celle kommunikation i epididymale epitel og med interstitielle celler.

Genetisk modificerede musemodeller har vist sig at være et effektivt redskab til identifikation / validering af molekylære mekanismer bag udvikling og sygdom af forskellige organsystemer ^6. Trods dens omfattende brug, er der væsentlige begrænsninger af genetisk modificerede musemodeller, herunder uforudsete fænotype af målrettede mus mutanter med hensyn til formodede genfunktion, og ingen fænotype i nulmutanter i nogle modeller, indflydelse af genetiske og miljømæssige faktorer, arbejdskrævende og tidskrævende proces med at udvikle musemodeller. Derfor fortolkningen af ​​betydningen af ​​resultaterne kun fra genetisk modicerede musemodeller er ikke altid ligetil ^6. Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af in vitro-orgel kultur system, der giver os fleksibilitet til at arbejde med flere signalveje i realtid i kontrollerede dyrkningsbetingelser. Organkultur system er medvirkende til at forstå fysiologi og patologi hele organer ^7. Endvidere billeddannelse af hele organer farvet med fluoroformærkede antistoffer kan vi visualisere markører af interesse i en tredimensionel kontekst, som den eksisterer in vivo, hvorved der tilvejebringes en bedre forståelse af organets form, struktur og funktion ^8.

Her har vi beskrevet de metoder til isolering af muse embryonale gonadale kamme, in vitro kultur og hele mount immunfluorescens billeddannelse af WDS, der kan anvendes til at besvare en række spørgsmål om morfogenese af rørformede organer såsom WDS. I denne protokol, viisolerede muse embryonale urogenitale kamme fra 15,5 dage efter coitum (dpc) gravide dæmninger og dyrket dem i 3 dage efterfulgt af immunfarvning for en epitelcelle markør (cytokeratin 8, Ck8), en celle proliferation markør (phospho-histon 3, PH3) og aktiv βcatenin.

Protocol

Animal pleje og eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Animal Care og etiske komité fra University of Newcastle og bekræftet til Forskning lov om New South Wales Animal, New South Wales Animal Research forordning, og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål. Alle de procedurer, der gennemføres på mus blev godkendt af Animal Care og etiske komité fra University of Newcastle. 1. Time Parring Pair 6 – 8 ug…

Representative Results

Under udvikling, WD foretages væsentlige ændringer, hvor en enkel og lige rør er omdannet til en meget kompleks og sammenrullet kanal. Anvendelse af fremgangsmåder beskrevet ovenfor, WDS undergår en lignende transformation i dyrkningsbetingelser. Her har vi vist resultaterne fra WDS dyrket i 3 d (figur 3). At dissekere molekylære mekanismer involveret i WD morfogenese, kan dyrkningsmediet suppleres med inhibitorer og aktivatorer rettet mod forskellige signalveje. Figur 3C viser ru…

Discussion

Den organkultur system har mange fordele frem for den traditionelle cellekultursystem. Dette system bevarer de oprindelige strukturelle relationer og interaktioner mellem forskellige celletyper. Det efterligner in vivo-systemer og giver mere præcise oplysninger end cellekultur studier, hvor den niche faktor er fraværende. Anvendelsen af ​​organsystemer dyrkningssystemer endda have fordele ved at benytte hele dyret. Disse omfatter de højere omkostninger ved at bruge hele dyret, nem pleje og vedligeholdels…

Materials

24 well plates	Corning, USA	3524	can be purchased from other vendors
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	can be purchased from other vendors
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS used in culture medium
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% concentration used
Penicillin-Streptomycin	Gibco, USA	15070-063	1% concentration used
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrane (0.8 mm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µM concentration used
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Very viscous, careful while dispensing
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Very viscous, careful while dispensing
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	can be purchased from other vendors
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	can be purchased from other vendors
Sodium Chloride	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	can be purchased from other vendors
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in blocking buffer
active βcatenin	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
Phospho-Histone3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in blocking buffer
Alexa594 Goat anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	1:250 in blocking buffer
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	can be purchased from other vendors
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370	–
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Use to stain nucleic acids (DNA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Solvent
Cover Slips (24×50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	–