Vi præsenterer en fremgangsmåde til isolering og dyrkning af muse Wolffian kanalen (WD). Vi viser også en detaljeret procedure for hele mount immunfarvning af dyrkede / frisk isolerede WDS med fluorescens mærkede antistoffer. Tilsammen udgør disse teknikker gør det muligt at studere WD udvikling, opvikling, og differentiering.
Tubal morfogenese er en grundlæggende forudsætning for udviklingen af de fleste pattedyr organer, herunder den mandlige reproduktive system. De epididymis, en integreret del af den mandlige reproduktive tarmkanalen, er ansvarlig for opbevaring af sæd, modning og transport. Den voksne epididymis er en meget coilrør der udvikler sig fra en enkel og lige embryonale precursor kendt som Wolffian kanal (WD). Korrekt oprulning af epididymis er afgørende for mandlige fertilitet, som sædceller i testiklerne ikke kan befrugte en oocyt. Men den mekanisme, der epididymis udvikling og oprulning er fortsat uklart, delvist på grund af manglen af hele organkultur og billeddannende metoder. I denne undersøgelse beskriver vi et in vitro kultursystem og hele mount immunofluorescens protokol bedre at visualisere processen med WD oprulningen og udvikling, som også kan anvendes til at studere andre rørformede organer.
Den mandlige reproduktive system består primært af testis, stedet for kimcelle udvikling og differentiering og et komplekst gangsystemet, der kræves for modningen, transport og opbevaring af sædceller. Epididymis er en rørformet organ, der forbinder testis med sædlederen og hovedsageligt involveret i post-testikelkræft udvikling og modning af kønsceller 1. De stærkt coiled voksne mus epididymis udvikler sig fra en enkel og lige precursor rør, Wolffian kanal (WD) 1. Komplekset og oprullede struktur epididymis er afgørende for sædcellerne at erhverve evnen til at befrugte kvindelige kønsceller 2. Hvordan sådan en vigtig organ for mandlig fertilitet udvikler og kommer i form er ikke godt forstået. Forskellige signalveje er blevet vist at være involveret i udviklingen af WD såsom Wnt signalvejen 3,4 og androgenet signalvejen 5. Vores seneste arbejde har etableret kravet om balbalanceret Wnt signalering til WD oprulning under prænatal udvikling 4. Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige for at forstå de mekanismer, der er involveret i postnatal epididymalt coiling, cellulær differentiering, og celle-til-celle kommunikation i epididymale epitel og med interstitielle celler.
Genetisk modificerede musemodeller har vist sig at være et effektivt redskab til identifikation / validering af molekylære mekanismer bag udvikling og sygdom af forskellige organsystemer 6. Trods dens omfattende brug, er der væsentlige begrænsninger af genetisk modificerede musemodeller, herunder uforudsete fænotype af målrettede mus mutanter med hensyn til formodede genfunktion, og ingen fænotype i nulmutanter i nogle modeller, indflydelse af genetiske og miljømæssige faktorer, arbejdskrævende og tidskrævende proces med at udvikle musemodeller. Derfor fortolkningen af betydningen af resultaterne kun fra genetisk modicerede musemodeller er ikke altid ligetil 6. Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af in vitro-orgel kultur system, der giver os fleksibilitet til at arbejde med flere signalveje i realtid i kontrollerede dyrkningsbetingelser. Organkultur system er medvirkende til at forstå fysiologi og patologi hele organer 7. Endvidere billeddannelse af hele organer farvet med fluoroformærkede antistoffer kan vi visualisere markører af interesse i en tredimensionel kontekst, som den eksisterer in vivo, hvorved der tilvejebringes en bedre forståelse af organets form, struktur og funktion 8.
Her har vi beskrevet de metoder til isolering af muse embryonale gonadale kamme, in vitro kultur og hele mount immunfluorescens billeddannelse af WDS, der kan anvendes til at besvare en række spørgsmål om morfogenese af rørformede organer såsom WDS. I denne protokol, viisolerede muse embryonale urogenitale kamme fra 15,5 dage efter coitum (dpc) gravide dæmninger og dyrket dem i 3 dage efterfulgt af immunfarvning for en epitelcelle markør (cytokeratin 8, Ck8), en celle proliferation markør (phospho-histon 3, PH3) og aktiv βcatenin.
Den organkultur system har mange fordele frem for den traditionelle cellekultursystem. Dette system bevarer de oprindelige strukturelle relationer og interaktioner mellem forskellige celletyper. Det efterligner in vivo-systemer og giver mere præcise oplysninger end cellekultur studier, hvor den niche faktor er fraværende. Anvendelsen af organsystemer dyrkningssystemer endda have fordele ved at benytte hele dyret. Disse omfatter de højere omkostninger ved at bruge hele dyret, nem pleje og vedligeholdels…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af gynækologi onkologi gruppen for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde er delvist støttet af midler fra National Health og Medical Research Council, Australian Research Council, og Cancer Institute NSW (PST). MK er en modtager af University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |