Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos
Summary
Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.
Abstract
morfogénesis de trompas es un requisito fundamental para el desarrollo de la mayoría de los órganos de mamíferos, incluyendo el sistema reproductivo masculino. El epidídimo, una parte integral del tracto reproductivo masculino, es responsable del almacenamiento de esperma, la maduración y el transporte. El epidídimo es un tubo de adultos altamente enrollado que se desarrolla a partir de una simple y directo precursor embrionario conocido como conducto de Wolff (WD). bobinado adecuada del epidídimo es esencial para la fertilidad masculina, ya que los espermatozoides en el testículo no son capaces de fertilizar un óvulo. Sin embargo, el mecanismo responsable del desarrollo de epidídimo y de bobinado no está claro, en parte debido a la falta de métodos de cultivo de órganos y de formación de imágenes enteras. En este estudio, se describe un sistema de cultivo in vitro y toda protocolo de inmunofluorescencia de montaje para visualizar mejor el proceso de bobinado WD y el desarrollo, que también puede ser aplicado al estudio de otros órganos tubulares.
Introduction
El sistema reproductor masculino consiste principalmente en los testículos, el sitio para el desarrollo de células germinales y la diferenciación, y un sistema ductal complejo que se requiere para la maduración, el transporte, y el almacenamiento de los espermatozoides. Epidídimo es un órgano tubular que conecta los testículos con los conductos deferentes y participa principalmente en el desarrollo post-testicular y la maduración de las células germinales 1. Los altamente espiral epidídimo de ratón adulto se desarrolla a partir de un simple y sencillo tubo de precursor, conducto de Wolff (WD) 1. La compleja estructura en espiral y del epidídimo es esencial que los espermatozoides adquieren la capacidad para fertilizar las células germinales femeninas 2. ¿Cómo un órgano tan esencial para la fertilidad masculina se desarrolla y se mete en la forma no se entiende bien. Varias vías de señalización se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de WD tales como la vía de señalización Wnt 3,4 y de la vía de señalización de 5 andrógenos. Nuestro trabajo reciente ha establecido el requisito de balANZAD señalización Wnt para WD bobinado durante el desarrollo prenatal 4. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender los mecanismos implicados en el bobinado posnatal del epidídimo, la diferenciación celular, y la comunicación de célula a célula en el epitelio del epidídimo y con las células intersticiales.
Modelos de ratones genéticamente modificados han demostrado ser una herramienta poderosa para la identificación / validación de los mecanismos moleculares desarrollo y la enfermedad de varios sistemas de órganos 6 subyacentes. A pesar de su amplio uso, existen limitaciones significativas de los modelos de ratones genéticamente modificados, incluyendo el fenotipo inesperado de los mutantes de ratón dirigidos con respecto a la función del gen presunta, y ningún fenotipo de mutantes nulos en algunos modelos, la influencia de los factores genéticos y ambientales, mano de obra y proceso que consume tiempo de desarrollar modelos de ratón. Por lo tanto, la interpretación de la importancia de los resultados sólo de los genéticamente modificadoscados modelos de ratón no siempre es sencillo 6. Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de sistema de cultivo de órganos in vitro que nos da la flexibilidad para manipular múltiples vías de señalización en tiempo real en las condiciones de cultivo controladas. Sistema de cultivo de órganos es instrumental en la comprensión de la fisiología y patología de órganos enteros 7. Por otra parte, de formación de imágenes de órganos enteros teñidas con anticuerpos fluoróforo marcado nos permite visualizar los marcadores de interés en un contexto de tres dimensiones, tal como existe in vivo, proporcionando de este modo una mejor comprensión de la forma del órgano, la estructura y función 8.
Aquí, hemos descrito los métodos para el aislamiento de ratón crestas gonadales embrionarias, el cultivo in vitro y su conjunto de imágenes de inmunofluorescencia monte de WDS, que se pueden aplicar para responder a una variedad de cuestiones relativas a la morfogénesis de órganos tubulares tales como WDS. En este protocolo, seaislados de ratón embrionario crestas urogenitales de 15,5 días postcoital (dpc) presas embarazadas y los cultivaron durante 3 d, seguido de la inmunotinción para un marcador de células epiteliales (citoqueratina 8, CK8), un marcador de proliferación celular (fosfo-histona 3, PH3) y activa βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de cultivo de órganos tiene muchas ventajas sobre el sistema de cultivo celular tradicional. Este sistema retiene las relaciones estructurales originales y las interacciones entre los diferentes tipos de células. Se imita en sistemas in vivo y da información más precisa que los estudios de cultivo celular en el que el factor de nicho está ausente. El uso de sistemas de cultivo de órganos incluso tener ventajas sobre el uso de todo el animal. Estos incluyen el mayor costo de la utilizac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del grupo de oncología ginecológica para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo está parcialmente financiada por el Consejo de Investigación Médica y Salud Nacional, el Consejo de Investigación Australiano, y el Instituto de Cáncer de Nueva Gales del Sur (PST). MK es un receptor de la Universidad de Newcastle Postgrado beca de investigación.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
