अंग संस्कृति और माउस Wolffian नलिकाओं का पूरा पर्वत इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
Summary
हम अलगाव और माउस Wolffian वाहिनी (DD) की संस्कृति के लिए एक तरीका मौजूद है। हम यह भी सुसंस्कृत / fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ हौसले से पृथक WDS के पूरे माउंट immunostaining के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है। साथ में, इन तकनीकों WD विकास, coiling, और भेदभाव के अध्ययन के लिए सक्षम है।
Abstract
ट्यूबल morphogenesis पुरुष प्रजनन प्रणाली सहित ज्यादातर स्तनधारी अंगों के विकास के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है। अधिवृषण, पुरुष प्रजनन तंत्र का एक अभिन्न हिस्सा है, शुक्राणु भंडारण, परिपक्वता, और परिवहन के लिए जिम्मेदार है। वयस्क अधिवृषण एक अत्यधिक कुंडलित ट्यूब कि एक सरल और सीधे भ्रूण Wolffian वाहिनी (DD) के रूप में जाना जाता है अग्रदूत से विकसित करता है। अधिवृषण के समुचित coiling पुरुष प्रजनन क्षमता के लिए आवश्यक है, के रूप में वृषण में शुक्राणु एक oocyte खाद करने में असमर्थ हैं। हालांकि, तंत्र अधिवृषणी विकास और coiling के लिए जिम्मेदार आंशिक रूप से पूरे अंग संस्कृति और इमेजिंग तरीकों की कमी के कारण, अस्पष्ट बनी हुई है। इस अध्ययन में, हम बेहतर WD coiling और विकास है, जो भी अन्य ट्यूबलर अंगों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है की प्रक्रिया कल्पना करने के लिए इन विट्रो संस्कृति प्रणाली और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का वर्णन।
Introduction
पुरुष प्रजनन प्रणाली मुख्य रूप से वृषण के होते हैं, रोगाणु सेल विकास और भेदभाव, और एक जटिल प्रणाली है कि नलीपरक परिपक्वता, परिवहन, और शुक्राणु के भंडारण के लिए आवश्यक है के लिए साइट। अधिवृषण एक ट्यूबलर अंग वीएएस deferens के साथ वृषण और मुख्य रूप से उत्तर-वृषण विकास और रोगाणु कोशिकाओं 1 की परिपक्वता में शामिल जोड़ता है। अत्यधिक कुंडलित वयस्क माउस अधिवृषण एक सरल और सीधे अग्रदूत ट्यूब, Wolffian वाहिनी (DD) 1 से विकसित करता है। अधिवृषण के जटिल और कुंडलित संरचना आवश्यक शुक्राणु मादा जनन कोशिकाओं 2 खाद के लिए क्षमता हासिल करने के लिए है। कैसे पुरुष प्रजनन के लिए इस तरह के एक आवश्यक अंग विकसित करता है और आकार में हो जाता है अच्छी तरह से समझ नहीं है। विभिन्न तरह के संकेत दे रास्ते Wnt संकेतन मार्ग 3,4 और एण्ड्रोजन मार्ग 5 संकेत के रूप में डब्लू डी के विकास में शामिल होना दिखाया गया है। हमारे हाल ही में काम Bal की आवश्यकता की स्थापना की हैसंतुलित Wnt जन्म के पूर्व का विकास 4 के दौरान WD coiling के लिए संकेत है। हालांकि, आगे की पढ़ाई अधिवृषणी उपकला भीतर और मध्य कोशिकाओं के साथ प्रसव के बाद अधिवृषणी coiling, सेलुलर भेदभाव, और सेल करने वाली कोशिका संचार में शामिल तंत्र को समझने के लिए आवश्यक हैं।
आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के विकास और विभिन्न अंग प्रणालियों 6 की बीमारी अंतर्निहित आणविक तंत्र की पहचान / सत्यापन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो गया है। इसकी व्यापक उपयोग के बावजूद, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की महत्वपूर्ण सीमाओं, माना जीन समारोह के संबंध के साथ लक्षित माउस म्यूटेंट के unpredicted phenotype, और कुछ मॉडल में अशक्त म्यूटेंट में कोई phenotype, आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव, श्रम गहन और भी शामिल हैं समय लेने वाली माउस मॉडल विकसित करने की प्रक्रिया। इसलिए, केवल आनुवंशिक रूप से मोदी से निष्कर्ष के महत्व की व्याख्याfied माउस मॉडल हमेशा सीधा 6 नहीं है। इन सीमाओं विट्रो अंग संस्कृति प्रणाली है जो हमें लचीलापन नियंत्रित संस्कृति की स्थिति में वास्तविक समय में कई संकेत दे रास्ते में हेरफेर करने देता है में उपयोग करके दूर किया जा सकता है। अंग संस्कृति प्रणाली शरीर विज्ञान और पूरे अंगों 7 की विकृति को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इसके अलावा, fluorophore लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग पूरी अंगों की इमेजिंग हमें एक तीन आयामी संदर्भ में ब्याज की मार्कर कल्पना करने के लिए, के रूप में यह विवो में मौजूद है, जिससे अंग के आकार, संरचना, और समारोह 8 का एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए सक्षम बनाता है।
यहाँ, हम माउस भ्रूण जननांगों लकीरें के अलगाव, इन विट्रो संस्कृति और WDS के पूरे माउंट immunofluorescence इमेजिंग के लिए तरीके, कि इस तरह के रूप में WDS ट्यूबलर अंगों के morphogenesis से संबंधित प्रश्नों की एक किस्म के जवाब देने के लिए लागू किया जा सकता वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल में, हमपृथक माउस भ्रूण 15.5 दिनों से मूत्रजननांगी लकीरें coitum (डीपीसी) गर्भवती बांधों पोस्ट और उनके लिए 3 डी एक उपकला सेल मार्कर (cytokeratin 8, CK8), एक सेल प्रसार मार्कर (phospho-Histone 3, PH3) और सक्रिय करने के लिए immunostaining द्वारा पीछा किया सुसंस्कृत βcatenin।
Protocol
Representative Results
Discussion
अंग संस्कृति प्रणाली पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणाली पर कई फायदे हैं। इस प्रणाली के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच मूल संरचनात्मक संबंधों और बातचीत को बरकरार रखे। यह विवो प्रणालियों में mimics औ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए स्त्री रोग कैंसर विज्ञान समूह के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद, और कैंसर संस्थान एनएसडब्ल्यू (पीएसटी) से धन के द्वारा समर्थित है। एमके न्यूकैसल स्नातकोत्तर रिसर्च फैलोशिप के विश्वविद्यालय के एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
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