Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama
Summary
Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.
Abstract
Tubal morphogenesis erkek üreme sistemi dahil olmak üzere pek çok memeli organların gelişimi için temel bir gerekliliktir. epididimis, erkek üreme sisteminin ayrılmaz bir parçası, sperm depolama, olgunlaşması ve ulaşım sorumludur. yetişkin epididimis Wolf kanalı (WD) olarak bilinen basit ve düz embriyonik habercisi gelişir oldukça sarmal tüp. testiste sperm oosit döller edemiyoruz olarak epididimin uygun kıvrılma, erkek doğurganlık için esastır. Ancak, epididimal geliştirme ve sarma sorumlu mekanizma kısmen tüm organ kültürü ve görüntüleme yöntemlerinin eksikliği, belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, biz daha iyi diğer boru şeklindeki organları incelemek için uygulanabilir WD sarma ve geliştirme, sürecini görselleştirmek için bir in vitro kültür sistemi ve tüm montaj immünofloresan protokol açıklar.
Introduction
Erkek üreme sistemi öncelikle testis oluşur, germ hücre gelişimi ve farklılaşmasında ve sperm olgunlaşması, ulaşım ve depolama için gerekli olan karmaşık bir duktal sistemi için site. Epididimis vas deferens ile testis ve germ hücrelerinin 1 post-testiküler gelişim ve olgunlaşma ağırlıklı olarak yer bağlayan bir boru şeklinde bir organdır. Çok sarmal yetişkin fare epididimis basit ve düz habercisi tüp, Wolf kanalı (WD) 1 gelişir. Sperm dişi germ hücrelerinin 2 dölleme kapasitesini elde etmek için epididimin karmaşık ve kangal yapısı esastır. erkek doğurganlık için böyle önemli bir organı şekline geliştirir ve alır ne kadar iyi anlaşılamamıştır. Çeşitli sinyal yolları gibi Wnt 3,4 ve yol 5 sinyal androjen olarak WD gelişiminde rol gösterilmiştir. Bizim son çalışmalar bal ihtiyacını kurmuşturanced Wnt doğum öncesi gelişim 4 sırasında WD sarma için sinyalizasyon. Ancak, ileri çalışmalar epididimal epitel içinde ve interstisyel hücreler ile doğum sonrası epididimal sarma, hücresel farklılaşma ve hücre-hücre iletişimi yer alan mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, çeşitli organ sistemlerinin 6 gelişimini ve hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanması / onaylama için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. geniş kullanılmasına rağmen, tahmin gen fonksiyonu açısından hedeflenen fare mutantlar öngörülemeyen fenotip ve bazı modellerde boş mutantlar hiçbir fenotip, genetik ve çevresel faktörlerin etkisiyle, emek yoğun ve dahil olmak üzere genetiği değiştirilmiş fare modelleri önemli kısıtlamalar vardır zaman alıcı fare modellerinin geliştirilmesi süreci. Bu nedenle, sadece genetik olarak modi gelen bulguların önemi yorumlanmasığı fare modelleri, her zaman 6 kolay değildir. Bu kısıtlamalar, bize kontrol kültür koşulları gerçek zamanlı olarak birden fazla sinyalleme yolunu değiştirmek için esneklik sağlar nitro organ kültür sisteminde kullanılarak aşılabilir. Organ kültürü sistemi bütün organların 7 fizyolojisini ve patolojisi ile ilgili vesile oluyor. Böylelikle organın şekil, yapı ve işlev 8 daha iyi anlaşılmasını sağlayan in vivo koşullarında varolduğu Dahası, florofor etiketli antikor ile boyandı Bütün organların görüntüleme, üç boyutlu bir bağlamda ilgi işaretleri görsel olanak sağlamaktadır.
Burada, örneğin WDS ile boru şekilli organ morfojenezi ilgili çeşitli sorulara cevap uygulanabilir fare embriyonik gonadal sırtlar izolasyonu, in vitro kültürü ve WDS'nin bütün montaj immünofloresan görüntüleme yöntemleri tarif etmişlerdir. Bu protokol, biz15.5 gün izole fare embriyonik ürogenital sırtlar coitum (DPC) hamile baraj sonrası ve bir epitel hücre markeri (sitokeratin 8, CK8), bir hücre çoğalması markeri (fosfo-Histon 3, PH3) ve aktif için immün ardından 3 gün boyunca onları kültüre βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organ kültürü sistemi, geleneksel hücre kültürü sistemi üzerinde birçok avantajı vardır. Bu sistem, farklı hücre tipleri arasında, orijinal yapısal ilişkiler ve etkileşimler korur. Bu in vivo sistemlerde taklit ve niş faktörü yoktur hücre kültürü çalışmalarında daha doğru bilgi verir. organ kültürü sistemlerinin kullanılması da bütün hayvan kullanımına kıyasla avantajlara sahiptir. Bunlar bütün hayvan, kolay bakım ve organ kültürü sisteminin bakım, vs Ayrı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu yazının eleştirel okuma için jinekoloji onkoloji grubu üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya Araştırma Konseyi ve Kanser Enstitüsü NSW (PST) fon tarafından desteklenmektedir. MK Newcastle Lisansüstü Araştırma Bursu Üniversitesi bir alıcı.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
