Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff
Summary
We presenteren een methode voor de isolatie en de cultuur van de muis Wolffian kanaal (WD). We hebben ook een gedetailleerde procedure voor de hele berg immunokleuring van gekweekte / vers geïsoleerde WDS met fluorescent gelabelde antilichamen aan te tonen. Samen vormen deze technieken kan de studie van de WD ontwikkeling, oprollen, en differentiatie.
Abstract
Tubal morfogenese een fundamenteel vereiste voor de ontwikkeling van de meeste zoogdieren organen, waaronder het mannelijke voortplantingssysteem. De bijbal, een integraal onderdeel van het mannelijke voortplantingsstelsel, is verantwoordelijk voor spermaopslag, rijping en transport. De volwassen bijbal is een zeer opgerolde slang die zich ontwikkelt van een eenvoudige en rechte embryonale voorloper bekend als Wolffian kanaal (WD). Goede oprollen van de bijbal essentieel is voor mannelijke vruchtbaarheid, zoals sperma in de testis niet een eicel te bevruchten zijn. Het mechanisme verantwoordelijk voor epididymis ontwikkeling en coiling blijft onduidelijk, mede door het ontbreken van hele orgaankweek en beeldvorming. In deze studie beschrijven we een in vitro kweeksysteem en geheel mount immunofluorescentie protocol bij het proces van WD coiling en ontwikkeling, die ook kan worden toegepast op andere buisvormige organen bestuderen beter zichtbaar.
Introduction
Het mannelijke voortplantingssysteem bestaat voornamelijk uit testis, de site voor kiemcellen ontwikkeling en differentiatie, en een complex ductaal systeem dat nodig is voor de rijping, transport en opslag van sperma. Bijbal is een buisvormig orgaan dat testis met zaadleiders en voornamelijk betrokken bij post-testis ontwikkeling en rijping van kiemcellen 1 verbindt. De zeer opgerolde volwassen muizen bijbal ontwikkelt zich van een eenvoudige en rechte voorloper buis, Wolffian kanaal (WD) 1. De complexe en gewikkelde structuur van epididymis is essentieel voor sperma het vermogen om vrouwelijke kiemcellen 2 bevruchten verkrijgen. Hoe zo'n belangrijk orgaan voor mannelijke vruchtbaarheid ontwikkelt en krijgt in vorm is niet goed begrepen. Verschillende signaalroutes bleken betrokken te zijn bij de ontwikkeling van WD zoals Wnt signaling pathway 3,4 en androgeen signaleringsroute 5. Onze recente werk is de eis van de bal gevestigdewichtige Wnt-signalering voor WD wikkelen tijdens de prenatale ontwikkeling 4. Echter, verder onderzoek nodig is om de mechanismen betrokken bij postnatale epididymis wikkelen, celdifferentiatie en cel-cel communicatie in de epididymis epitheel en interstitiële cellen te begrijpen.
Genetisch gemodificeerde muismodellen hebben bewezen een krachtig instrument voor de identificatie / validering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en de ziekte van de verschillende orgaansystemen 6 zijn. Ondanks het veelvuldig gebruik, zijn er aanzienlijke beperkingen van genetisch gemodificeerde muismodellen, zoals de onvoorziene fenotype gerichte muizenmutanten met betrekking tot veronderstelde genfunctie en geen fenotype in null mutanten in sommige modellen invloed van genetische en omgevingsfactoren, arbeidsintensief en tijdrovende proces van het ontwikkelen muismodellen. Daarom is de interpretatie van de betekenis van de bevindingen enige genetisch modified muismodellen is niet altijd eenvoudig 6. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door in vitro orgelcultuur systeem dat ons de flexibiliteit om meerdere signaalwegen in real time onder gecontroleerde kweekomstandigheden manipuleren geeft. Orgelcultuur systeem is instrumenteel in het begrijpen van de fysiologie en pathologie van hele organen 7. Bovendien beeldvorming van gehele organen gekleurd met fluorofoor gemerkte antilichamen kunnen wij de markers van belang visualiseren in een driedimensionale context, zoals bekend in vivo, waardoor een beter begrip van de vorm van het orgel, structuur en functie 8.
Hier hebben we de werkwijzen voor isolatie van muis embryonale gonadale richels, in vitro kweek en volledige mount immunofluorescentie beeldvorming van WDS, die kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen met betrekking tot de morfogenese van buisvormige organen zoals WDS beantwoorden beschreven. In dit protocol, wegeïsoleerde muis embryonale urogenitale ruggen van 15,5 dagen na coïtum (DPC) zwanger dammen en gekweekt hen gedurende 3 dagen gevolgd door immunokleuring voor epitheliale cellen marker (cytokeratine 8, CK8), een celproliferatie marker (fosfo-histon 3, PH3) en actieve βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het orgelcultuur systeem heeft vele voordelen boven de traditionele celcultuur. Dit systeem behoudt de oorspronkelijke structurele relaties en interacties tussen verschillende celtypen. Het bootst in vivo systemen en geeft meer accurate informatie dan celcultuur studies waar de niche factor is afwezig. Het gebruik van organen kweeksystemen zelfs voordelen boven het gebruik van het gehele dier. Deze omvatten de hogere kosten van het gebruik van het gehele dier, gemakkelijk onderhoud van orgaan- kweeksysteem, <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen graag de leden van de gynaecologische oncologie groep bedanken voor de kritische lezing van dit manuscript. Dit werk wordt mede ondersteund door de financiering van de National Health en Medical Research Council, de Australian Research Council, en de Kanker Instituut NSW (PST). MK is een ontvanger van de Universiteit van Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
