HDAC 抑制剂介导的 B 细胞 rna 和基因的基因组分析--诱导进行类开关 DNA 重组和血浆细胞分化
Summary
后生因素可以与基因程序相互作用, 调节基因表达, 调节 B 细胞功能。结合体外b 细胞刺激、qRT PCR、高通量 rna 序列和 mRNA 序列方法, 可以分析 b 细胞中 miRNA 和基因表达的表观遗传调控。
Abstract
抗体应答是通过几个关键的 B 细胞内在的过程来完成的, 包括体细胞变异 (SHM), 类开关 DNA 重组 (CSR) 和血浆细胞分化。近年来, 表观遗传修饰或因素, 如组蛋白脱乙酰和 rna (rna), 已被证明与 B 细胞的遗传程序, 以形成抗体反应, 而表观遗传因素的功能障碍已发现导致自身抗体应答。分析 b 细胞的基因组全 miRNA 和 mRNA 表达对表观遗传调节因子的反应, 对于了解 b 细胞功能和抗体应答的表观遗传调节具有重要意义。在这里, 我们演示了一个协议诱导 b 细胞进行 CSR 和细胞分化, 治疗这些 b 细胞与组蛋白乙酰 (HDAC) 抑制剂 (助), 并分析 mRNA 和 rna 表达。在这个协议, 我们直接分析互补 DNA (cDNA) 序列使用下一代 mrna 测序 (mrna-seq) 和 miRNA 的技术, 测序读取的基因组, 和定量的反向转录 (qRT)-PCR。通过这些方法, 我们已经定义, 在 B 细胞中诱导的 csr 和细胞分化, 人类发展指数, 一个后生的调节器, 选择性地调节 miRNA 和 mRNA 表达, 改变 csr 和细胞分化。
Introduction
表观遗传标记或因素, 如 DNA 甲基化, 组蛋白后修饰, 编码 rna (包括 rna), 通过改变基因表达1调节细胞功能。表观遗传修饰调节 b 淋巴细胞功能, 如免疫球蛋白类-开关 DNA 重组 (CSR), 体细胞变异 (SHM), 并分化为记忆 b 细胞或血浆细胞, 从而调节抗体和自我抗体响应2,3。CSR 和 SHM 的关键要求激活诱导的胞脱氨酶 (援助, 编码为Aicda), 这是高度诱导 B 细胞响应 t 依赖性和 t 独立抗原4。类交换/hypermutated b 细胞进一步分化成血浆细胞, 其中分泌大量的抗体在时尚严重依赖于 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (Blimp1, 编码为Prdm1)5。B 细胞异常的表观遗传变化可能导致异常的抗体/自身抗体应答, 这会导致过敏反应或自身免疫1,4。了解后生因素, 如 rna, 调节 B 细胞内在基因表达不仅对疫苗的发展很重要, 而且对于揭示潜在的异常抗体/自身免疫反应的机制也是必不可少的。
组蛋白乙酰化和脱乙酰度是由组蛋白乙酰 (HAT) 和组蛋白乙酰 (HDAC) 催化的蛋白组蛋白的赖氨酸残留修饰。这些修改导致染色质的增加或减少的可及性, 并进一步允许或阻止转录因子或蛋白质与 DNA 的结合和基因表达的改变5,6,7,8. HDAC 抑制剂 (HDI) 是一类干扰 HDACs 功能的化合物。在这里, 我们使用 HDI (VPA) 来解决 HDAC 对 B 细胞固有基因表达谱的调节及其机制。
rna 是小的, 编码 rna 大约18到22核苷酸长度是通过几个阶段产生的。miRNA 寄主基因转录和形成发夹主 rna (pri-rna)。它们被出口到细胞质中, 其中 rna 被进一步加工成前体 rna (pre-miRNAs)。最后, 成熟的 rna 是通过 pre-miRNAs 的裂解形成的。rna 识别在其目标基因的 3 “未翻译区域” 中的互补序列6,7。通过后沉默, rna 调节细胞活动, 如增殖, 分化, 和凋亡10,11。由于多个 rna 可以针对同一 mRNA, 而一个单一的 miRNA 可能针对多个基因, 因此重要的是要有一个上下文视图的 miRNA 表达式配置文件, 以了解个人的价值和 rna 的集体效应。rna 已被证明参与 b 细胞的发育和外周分化, 以及 b 细胞阶段特异性分化, 抗体应答, 和自身免疫1,4,9。在 3 “UTR Aicda和Prdm1中, 有几个经过验证或预测的进化保守站点, 可通过 rna8进行攻击。
后生调制, 包括组蛋白后修饰和 rna, 显示一个细胞类型和细胞阶段特异的基因表达调控模式9。在这里, 我们描述的方法, 以确定人的 HDI 介导的 miRNA 和 mRNA 表达, 社会责任, 和血浆细胞分化。其中包括诱导 B 细胞接受 CSR 和细胞分化的协议;用 HDI 治疗 B 细胞;并通过 qRT PCR、miRNA-seq 和 mrna-seq10、11、12、813来分析 miRNA 和 mrna 的表达。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议提供了诱导 B 细胞类交换和细胞分化的综合方法;分析其对表观遗传调节剂的影响, 即 HDI;并检测人的 HDI 对这些细胞的 mRNA 和 miRNA 表达的影响。大多数这些方法也可以用来分析表观遗传因子对人 B 细胞功能和 mRNA/miRNA 表达的影响。qRT PCR 和 mRNA-seq/miRNA 的方法也可以用来分析 B 细胞分离的小鼠与后生调节剂, 如助。
表观遗传调节可能影响细胞增殖和活力等多种不同的细胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到 NIH 资助 ai 105813 和 ai 079705 (对 pc), 狼疮研究的目标识别联盟狼疮补助金 ALR 295955 (对 pc), 和关节炎国家研究基金会研究补助金 (HZ)。TS 由中国长沙中南大学第二湘医院儿科医学中心支持, 湘医学院圣安东尼奥医科学生访问计划的背景。
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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