分析突触调制<em>果蝇</em>曝光时间延长后，光光感受器
Summary
在这里，我们将展示如何量化的数量和果蝇光感受器突触活动区域的空间布局，突出了遗传编码的分子标记，并长时间暴露于光后的调制。
Abstract
神经系统有适应和各种刺激作出反应的非凡能力。这种神经调节主要是在突触水平通过可塑性来实现的。活动区（亚利桑那州）是在该介导神经递质的释放，并且由支架蛋白的致密集合的突触前膜的区域。 果蝇的锆刚玉（ 果蝇 ）光感受器长时间暴露在自然光环境发生后重塑分子。因而神经元活性的水平可以重新排列AZ的分子组成和向功能输出的调节。
从曝光设置准备到免疫组开始，该协议细节如何量化数，空间分布，并且在AZS 果蝇光感受器突触分子的离域电平。使用图像分析SOFtware，绿色荧光蛋白融合AZ成分Bruchpilot集群被认定为每个R8感光器（R8）轴突终端。检测Bruchpilot点被自动分配给各个R8轴突。要计算点频率沿轴突的分布，我们实现了一个定制的软件插件。每个轴突的开始点和结束点进行人工定义和每个Bruchpilot光斑的位置被投影到的开始和结束点之间的连接线。除了Bruchpilot簇的数目，我们还定量Bruchpilot-GFP的簇内的离域电平。这些测量反映详细在单个神经元的空间分辨突触动力学不同环境条件下对刺激。
Introduction
突触功能的调制有助于神经系统的显着能力精确响应或适应不断变化的环境刺激。调节突触前小泡释放的概率是控制突触强度1的一种方法。突触囊泡释放在活动区（AZ），突触前膜2的一个专门区域发生。在AZ的特征在于特定蛋白质3 4的盒，。促进AZ组装大多数蛋白质是高度保守的线虫，昆虫和哺乳动物5。最近的研究表明，神经元活动的水平调节AZ，这又在体外和体内 6,7有助于官能输出的调节的分子组成，> 8。我们以前发现，感光AZS发生在果蝇分子重塑长时间暴露在自然的环境光9点以后。在这种情况下，我们观察到Bruchpilot（BRP）阳性AZS的数量在感光体轴突降低。
该BRP / CAST / ELKS家族蛋白是脊椎动物和无脊椎动物神经突触10 AZS的基本构件。在果蝇突变BRP，诱发囊泡释放被抑制11，12。 BRP的17 C-末端氨基酸残基是在果蝇神经肌肉接头（NMJ）13,14突触小泡簇的关键。这些研究证明这种分子在亚利桑那州的组织和功能的核心作用。与最近开发的基因工具，突触标记与重组（STAR），BRP可以在特定细胞类型的体内观察到的，在内源表达水平和在单个突触决议15。这个工具使得它可行的定量评价在复杂的中枢神经系统突触的内生动力。
已经有多项研究，包括基于从共聚焦显微镜获得的数据突触quantifications。突触改动了测量的长度，面积，体积，密度和基于复杂的软件应用计数的数目进行评价。例如，免费软件ImageJ的提供了用于总突触面积，并在果蝇 NMJ 16突触密度措施定量方法。前期和突触后标记的共定位网站的数量一直在使用插件“泪点分析仪的”ImageJ的软件平台17可量化。替代地，多参数adigm数值计算环境的基础方案，突触检测器（SynD），可以自动跟踪标记有荧光标记的神经元的树突，然后量化突触蛋白水平作为距离从细胞体18的功能。软件突触泪点分析（SynPAnal），已被设计用于从共焦或荧光显微镜获取的神经元的二维图像的快速分析。该软件的主要功能是蛋白质泪点19的密度和强度的自动和快速定量。近日，在3D突触20多项量化已生成一个自动基于学习的突触检测算法，采取的三维可视化辅助分析（Vaa3D）软件21的优势。
商业图像分析软件也是突触quantifications的强大工具。例如，荧光标记的神经递质受体或突触前AZ组件已在三个维度与C中的单突触分辨率线虫 22或果蝇嗅觉系统23，24，使数百突触被快速地特征在于单个样品中进行定量。
这里，我们通过定制图像分析软件呈现一个方法插件在一个多范式数值计算环境，允许分析AZS的半自动多个方面，包括它们的数量，分布和分子成分浓缩到水平实现在AZ。因此，这种复杂的分析使我们能够评估在不同环境条件下轴突终末突触部件的动力学。我们研究了成年果蝇光感受器的输出突触曝光的效果。这个程序是在三个步骤执行：1）对于光照射，2）夹层，免疫组织化学和共焦成像，3）图像分析制剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项研究中，我们展示了如何准备光照条件下暴露苍蝇平等的光强度。那么，定量突触标记泪点的数量，但也可以在空间上解决突触沿轴突密度，并测量在细胞质区域的标志物蛋白的离域电平。这三个评估允许我们在不同环境条件下的单神经元水平评价突触动力学的细节。我们的协议可以适应不同的突触蛋白，而且对包含点状的信号的任何数据。
该协议中的关键步骤是大?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢T.Stürner对稿件有益的修正，讨论和评论; SL Zipursky提供即时的股票;中号Schölling用于进行图像处理。图像分析部分A处Kakita的实验室中进行。这项工作是由亚历山大·冯·洪堡基金会和日本学术振兴会奖学金为研究海外（AS），日本学术振兴会研究员（SH-S），格兰特 – 在 – 援助启动（24800024），对创新领域（25110713），持田的支持，武田，稻盛和夫，第一三共，东丽基金会（TS），DZNE核心资金（GT）和DZNE光学显微镜基金（CM）。
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
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