Analyse Synaptic Modulation de<em> Drosophila melanogaster</em> Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée
Summary
Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.
Abstract
Le système nerveux a la remarquable capacité d'adaptation et de répondre à différents stimuli. Cet ajustement neuronal est largement atteint grâce à la plasticité au niveau synaptique. La zone active (AZ) est la région à la membrane présynaptique qui médie la libération des neurotransmetteurs et est composé d'une collection dense de protéines d'échafaudage. AZS de Drosophila melanogaster (drosophile) photorécepteurs subir un remodelage moléculaire après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle. Ainsi, le niveau de l'activité neuronale peut réorganiser la composition moléculaire de l'AZ et de contribuer à la régulation de la sortie fonctionnelle.
A partir de l'exposition à la lumière de préparation mis en place pour l'immunohistochimie, ce protocole détaille comment quantifier le nombre, la répartition spatiale, et le niveau de délocalisation des molécules synaptiques à AZS dans les photorécepteurs de drosophile. En utilisant l'analyse d'image software, des grappes de l'AZ composant GFP fusionné Bruchpilot ont été identifiés pour chaque photorécepteur R8 (R8) terminaison axonale. taches Bruchpilot détectées sont automatiquement affectées à axones R8 individuels. Pour calculer la distribution de fréquence ponctuelle le long de l'axone, nous avons implémenté un plugin personnalisé. de point de départ de chaque axone et point final ont été définis manuellement et la position de chaque tache Bruchpilot a été projeté sur la ligne de liaison entre le début et la fin du point. Outre le nombre de grappes Bruchpilot, nous avons également quantifié le niveau de délocalisation de Bruchpilot-GFP dans les clusters. Ces mesures reflètent en détail la dynamique synaptiques résolus spatialement dans un seul neurone dans différentes conditions environnementales aux stimuli.
Introduction
La modulation de la fonction synaptique contribue à la remarquable capacité du système nerveux pour répondre précisément ou adapter à l'évolution des stimuli environnementaux. Réglage de la libération des vésicules présynaptique probabilité est un moyen de contrôler la force synaptique 1. La libération des vésicules synaptiques a lieu à la zone active (AZ), une région spécialisée de la membrane présynaptique 2. AZ est caractérisée par une cassette de protéines spécifiques 3, 4. La plupart des protéines qui contribuent à AZ assemblage sont hautement conservés dans les nématodes, les insectes et les mammifères 5. Des études récentes suggèrent que le niveau de l' activité neuronale régule la composition moléculaire de l'AZ, qui à son tour contribue à la régulation de la sortie fonctionnelle à la fois in vitro et in vivo 6, 7,> 8. Nous avons déjà constaté que AZS photoréceptrices subissent un remodelage moléculaire chez la drosophile après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle 9. Dans cette condition, nous avons observé que le nombre de Bruchpilot (Brp) -positif AZS a été réduit dans les axones photoréceptrices.
Les protéines Brp / CAST / famille ELKS sont des blocs de construction fondamentaux de AZS dans vertébrées et invertébrées synapses 10. Chez les mutants de Drosophila BRP, a évoqué la libération des vésicules est supprimée 11, 12. Les 17 résidus C-terminaux acides aminés de Brp sont essentiels pour le regroupement des vésicules synaptiques au Drosophile Jonction neuromusculaire (NMJ) 13, 14. Ces études ont démontré le rôle central de cette molécule dans l'organisation et la fonction AZ. Avec un outil génétique récemment mis au point, Synaptic Tagging avec Recombinaison (StAR), Brppeut être observée in vivo dans des types cellulaires spécifiques, à des niveaux d'expression endogènes et à une résolution de 15 synapses unique. Cet outil rend possible d'évaluer la dynamique endogène de synapses quantitativement dans le système nerveux central complexe.
Il y a eu plusieurs études, y compris quantifications synaptiques à partir des données obtenues à partir de la microscopie confocale. modifications synaptiques ont été évalués en mesurant la longueur, la zone, le volume, la densité et le comptage du nombre basé sur des applications logicielles sophistiquées. Par exemple, le ImageJ freeware fournit une méthode de quantification pour la zone synaptique totale et des mesures de densité synaptiques au Drosophile NMJ 16. Le nombre de sites de colocalisation des marqueurs pré et post – synaptiques ont été quantifiées à l' aide du plug – in "punctas Analyzer" disponible sur la plate – forme de logiciel ImageJ 17. Alternativement, un multi-pairprogramme basé adigm environnement de calcul numérique, Synapse détecteur (SYND), peut automatiquement tracer dendrites des neurones marqués avec un marqueur fluorescent, puis quantifie les niveaux de protéines synaptiques en fonction de la distance du corps de cellule 18. Le logiciel Synaptic punctas Analysis (SynPAnal), a été conçu pour l'analyse rapide des images 2D de neurones acquises par microscopie confocale ou fluorescent. La fonction principale de ce logiciel est la quantification automatique et rapide de la densité et de l' intensité de la protéine 19 lacrymaux. Récemment, un algorithme automatique basé sur l' apprentissage de détection de synapse a été généré pour la quantification du nombre synaptique en 3D 20, en profitant du logiciel d' analyse 3D Visualization assistée (Vaa3D) 21.
logiciel d'analyse d'image commerciale sont également des outils puissants pour quantifications synaptiques. Par exemple, la fluorescence,les récepteurs des neurotransmetteurs marqué ou un composant AZ présynaptique ont été quantifiés en trois dimensions avec une résolution individuelle synapses dans C. elegans 22 ou le système olfactif de drosophile 23, 24, permettant à des centaines de synapses à caractériser rapidement dans un seul échantillon.
Ici, nous présentons une méthode par un logiciel d'analyse d'image personnalisée plug-in mis en œuvre dans un environnement de calcul numérique multi-paradigme qui permet d'analyser semi-automatiquement plusieurs aspects de AZS, y compris leur nombre, la répartition et le niveau d'enrichissement de composants moléculaires l'AZ. Ainsi, cette analyse complexe nous a permis d'évaluer la dynamique des composantes synaptiques dans les terminaisons axonales dans différentes conditions environnementales. Nous avons étudié l'effet de l'exposition à la lumière sur les synapses de sortie des photorécepteurs de mouches adultes. La procédure est réalisée en trois étapes: 1)préparation pour exposition à la lumière, 2) la dissection, l'immunohistochimie et l'imagerie confocale, et 3) l'analyse d'image.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons montré comment préparer les conditions de lumière pour exposer les mouches à une intensité lumineuse égale. Nous avons quantifié non seulement le nombre d'un marqueur puncta synaptique, mais pourrait aussi spatialement résoudre la densité des synapses le long des axones et de mesurer le niveau de la protéine marqueur dans les zones cytoplasmiques de délocalisation. Ces trois évaluations nous permettent d'évaluer les détails de la dynamique synaptiques au niveau du neur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à T. Stürner pour les corrections utiles, des discussions et des commentaires sur le manuscrit; SL Zipursky pour fournir des stocks de mouches; M Schölling pour effectuer un traitement d'image. Une partie de l'analyse d'image a été réalisée au laboratoire de A. Kakita. Ce travail a été soutenu par la fondation Alexander von Humboldt et bourses JSPS pour la recherche à l'étranger (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In Aide pour le démarrage (24800024), sur les zones innovantes (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Fondations Toray (TS), le financement de base DZNE (GT) et des installations DZNE Lumière Microscopy (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
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