Summary

Un<em> Ex Vivo</em> Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks

Published: February 09, 2017
doi:

Summary

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Abstract

Angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, implique des cellules endothéliales, péricytes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires, et la coordination avec les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Le multi-cellulaire, les interactions multi-système nécessite l'enquête de l'angiogenèse dans un environnement physiologiquement pertinents. Ainsi, alors que l'utilisation de modèles in vitro de cultures cellulaires ont fourni des indications mécanistes, une critique commune est qu'ils ne récapitulent la complexité associée à un réseau microvasculaire. L'objectif de ce protocole est de démontrer la capacité de faire des comparaisons time-lapse de réseaux microvasculaires intacts avant et après stimulation de l'angiogenèse dans les tissus mésentère de rat en culture. tissus de culture contiennent des réseaux microvasculaires qui maintiennent leur hiérarchie. marquage immunohistochimique confirme la présence de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les pericytes, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques. Dans unddition, marquage de tissus avec une lectine BSI permet de comparer le temps écoulé des régions du réseau local avant et après la stimulation du facteur de croissance ou du sérum, caractérisé par une augmentation de la germination et de la densité capillaire du récipient. En comparaison avec les modèles de culture cellulaire communs, cette méthode fournit un outil pour les études endothéliales de la lignée cellulaire et évaluation du médicament angiogénique spécifique de tissu dans les réseaux microvasculaires physiologiquement pertinents.

Introduction

La croissance du réseau microvasculaire et le remodelage des dénominateurs communs pour la fonction des tissus, la cicatrisation des plaies, et de multiples pathologies et un processus clé est l' angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux qui existent déjà 1, 2. Pour les tissus d'ingénierie de nouveaux navires ou la conception de thérapies angiogéniques, la compréhension de l'importance de la dynamique cellulaires impliqués dans l'angiogenèse est critique. Cependant, ce procédé est complexe. Elle peut varier à des emplacements spécifiques à l' intérieur d' un réseau microvasculaire et implique plusieurs types de cellules ( par exemple les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes, des macrophages, des cellules souches) et plusieurs systèmes (réseaux lymphatiques et des réseaux de neurones). Bien que les modèles in vitro ont contribué énormément à l' examen de la relation entre les différentes cellules impliquées dans l' angiogenèse 3, leur pertinence physiologique peut être compromise en raison de Thei r complexité limitée et le fait qu'ils ne reflètent pas étroitement un scénario in vivo. Pour surmonter ces limitations, les systèmes de culture en trois dimensions 3 modèles de tissus, ex vivo 4, les systèmes microfluidiques 5, 6 et 7 modèles de calcul ont été élaborés et mis en place au cours des dernières années. Cependant, il existe encore un besoin d'un modèle avec une capacité time-lapse pour étudier l' angiogenèse dans les réseaux microvasculaires intacts ex vivo. La mise en place de nouveaux modèles time-lapse pour les études de l'angiogenèse avec ce niveau de complexité fournira un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent l'angiogenèse et d'améliorer les thérapies.

Un modèle de potentiel qui permet à l'étude ex vivo de l' angiogenèse à travers un réseau microvasculaire intacte est le mésentère modèle de culture de rat> 8. Dans des travaux récents, nous avons démontré que le sang et les réseaux microvasculaires lymphatiques restent viables après culture. Plus important encore, le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour étudier les interactions fonctionnelles de péricytes-endothélial cellulaires, le sang et les connexions des cellules endothéliales lymphatiques et imagerie time-lapse. L'objectif de ce document est de fournir notre protocole pour la méthode d'imagerie time-lapse. Nos résultats représentatifs de documenter les multiples types de cellules qui demeurent viables après la stimulation de l'angiogenèse avec du sérum et offrent des exemples d'utilisation de cette méthode pour quantifier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus ainsi que des études de suivi des cellules endothéliales.

Protocol

Toutes les expériences et les procédures animales ont été approuvées par Institutional Care Committee et l'utilisation des animaux de l'Université de Tulane (IACUC). 1. Configuration de la procédure chirurgicale instruments autoclaves, des fournitures chirurgicales et les fournitures de culture avant la chirurgie. fournitures chirurgicales pour chaque rat comprennent: 1 drap, 1 drap avec trou prédécoupé (0,5 po x 1,5 po) dans le centre, des tampons de gaze, et 1 …

Representative Results

Après 3 jours de culture, les tissus ont été marqués avec un kit mort en direct / viabilité / cytotoxicité pour démontrer la viabilité de la microvascularisation dans le modèle de culture mésentère de rat (figure 2A). La majorité des cellules présentes dans le mésentère est restée viable dans la culture où les cellules endothéliales ont été identifiées en fonction de leur emplacement dans les segments microvasculaires. La prolifération des cellules …

Discussion

Ce protocole documente une méthode pour utiliser le modèle de culture de mésentère de rat comme un ex vivo outil pour imagerie time-lapse de la croissance du réseau microvasculaire. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a établi l'utilisation de notre modèle pour 1) l' angiogenèse 8, 2) lymphangiogenèse 8, 3) les interactions cellulaires péricytes-endothélial 8, et 4) le dépistage des drogues anti-angiogénique …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

Materials

Drape Cardinal Health 4012 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5ml Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/ml
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/ml
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

References

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Cite This Article
Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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